Количественная оценка дендритных шипиков с помощью конфокальной микроскопии

Возьмем, к примеру, пирамидальные нейроны, которые трансдуцируются и иммунометятся до флуоресцентного зеленого цвета.

Получение изображений нейронов с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с настройками, отрегулированными для обеспечения оптимального качества изображения.

Откройте изображение с помощью специализированного программного обеспечения и используйте фильтр Гаусса для уменьшения фонового шума.

Выполните полуавтоматическую трассировку дендритов, предварительно оценив диаметр дендритов. Затем выберите начальную точку, путь и конечную точку дендрита.

Для автоматической сегментации позвоночника выберите Восстановить диаметр дендрита и установите пороговое значение объема дендритов, чтобы представить фактический объем дендритов.

Укажите значения наименьшего диаметра головки шипа и максимальной длины шипа.

Отрегулируйте порог для точек, представляющих шипы, обеспечив их локализацию на реальных головках колючек.

Задайте параметры для классификации колючек по длине, диаметру головы и форме.

Сгенерируйте 3D-модель дендрита с шипами и экспортируйте данные для дальнейшего анализа.

Под конфокальным микроскопом выберите не менее 10 здоровых нейронов для каждого состояния с пирамидальной морфологией и полной дендритной арборизацией. Чтобы количественно определить концентрацию от 60 до 100 микрометров на дендрит, получите изображения с помощью 40-кратного масляного объектива NA 1.3 и 488-нанометрового лазера с типичной пиковой мощностью на уровне образца около 20 микроватт.

Установите размер пикселя около 80 нанометров, чтобы правильно сэмплировать дендритные шипы. Чтобы получить выборку всего объема нейрона, получите стек Z с расстоянием по z от 150 до 300 нанометров, что даст от 20 до 30 z-срезов. Чтобы провести 3D-количественное определение дендритных шипов, используйте следующие настройки программного обеспечения для анализа.

Для предварительной обработки используйте фильтрацию по Гауссу, выбрав «Обработка изображений», «Сглаживание», «Фильтр Гаусса». Установите ширину фильтра равной размеру пикселя в плоскости XY. Чтобы выполнить полуавтоматическую трассировку дендритов из модуля трассировщика нитей на вкладке Срез, используйте инструмент Расстояние для оценки диаметра дендритов.

Затем на вкладке «Превзойти» нажмите на инструмент «Нити» и выберите «Пропустить автоматическое создание» для лучшей надежности. На открывшейся вкладке «Рисование» выберите метод «Автопуть», тип «Дендрит» и введите предполагаемый диаметр дендрита. Используя режим выбора указателя, превратите курсор в прямоугольник, выберите Shift и щелкните правой кнопкой мыши по начальной точке дендрита. Программное обеспечение выполнит первоначальные расчеты.

Теперь переместите указатель вдоль дендрита. От начальной точки отображается желтая линия, представляющая наиболее вероятный путь дендритов. Нажмите клавишу Shift и щелкните левой кнопкой мыши по конечной точке дендрита. Чтобы провести автоматическую сегментацию позвоночника, в интерфейсе модуля нажмите на вкладку «Создание». В выпадающем списке восстановления выберите «Восстановить диаметр дендрита» и установите флажок «Сохранить данные». Затем нажмите кнопку Перестроить.

Установите порог таким образом, чтобы сегментированный объем соответствовал фактическому объему дендритов. В качестве алгоритма выберите кратчайшее расстояние на карте расстояний. Затем нажмите кнопку «Далее». На вкладке «Срез» определите наименьший диаметр головки шипа и максимальную длину.

Затем на вкладке Превзойти введите параметры. Значения от 200 до 300 нанометров для минимального диаметра и 4 микрометра для максимальной длины являются хорошими отправными точками. Не ставя галочку в поле «Разрешить шипы», нажмите кнопку «Далее».

Затем отрегулируйте порог начальных точек таким образом, чтобы синие точки, представляющие шипы, локализовались относительно фактических головок шипов. Затем нажмите «Далее». Теперь будет выполнен расчет керна, который может занять некоторое время. Чтобы классифицировать шипы, на вкладке «Инструменты» интерфейса модуля нажмите «Классифицировать шипы».

После проверки того, что в текстовом протоколе описаны четыре класса, интерфейс модуля сгенерирует четыре новых объекта филамента с результатами классификации. Наконец, экспортируйте статистические данные на вкладке «Статистика», нажав «Экспортировать всю статистику в файл».