Аутологичных эндотелиальных клеток-предшественников-Посев Технология и Биосовместимость Тестирование Для сердечно-сосудистой устройства в Большой Модель животных

Общая цель данного эксперимента заключается в заселении сосудистых имплантатов аутологичными эндотелиальными прогениторными клетками, полученными из крови, с последующим наблюдением за влиянием данной терапии на тромбоз на модели крупных животных. Для этого из периферической крови свиней получают образец для изоляции поздних выросших эндотелиальных прогениторных клеток свиньи. Далее используется имплантируемое устройство.

В нашем исследовании по подтверждению концепции титановая трубка заселяется аутологичными ПК. Затем устройство имплантируется в нижнюю полую вену свиньи. Результаты показывают защиту от тромбоза, основанную на проходимости титановой трубки, заселенной ЭПК, по сравнению с контрольной группой и окклюзированной металлической трубкой без покрытия.

Хирургический факультет Университета Дьюка стремится поддерживать новаторские и инновационные исследования. Следующая презентация является примером того, как мы взаимодействуем между кафедрами и дисциплинами для развития медицины. Доктор EK возглавляет исследовательскую работу по разработке технологии «клеточного посева», которая позволит предотвратить тромбоз путем покрытия поверхности сосудистых устройств, контактирующей с кровью, собственными клетками-предшественниками пациента.

Поскольку эти клетки были получены от тех же пациентов, которые получат имплантат, мы избегаем отторжения иммунной системой. Наш успех и описанные здесь методы являются результатом усилий большой команды. Хирургическую имплантацию продемонстрируют Шон Гейдж из отделения сосудистой хирургии, Уитни Лейн, студент медицинского факультета Университета Дьюка, и я сам.

Теперь я хочу представить Александра Янссена, докторанта кафедры биомедицинской инженерии, который подробно расскажет нам о процессе посева клеток. Я продемонстрирую, как засеивать титановые трубки эндотелиальными прогениторными клетками, полученными из крови, непосредственно перед имплантацией в модель свиньи. Этот метод служит подтверждением концепции, и те же базовые принципы могут быть применены ко многим другим имплантируемым устройствам, таким как нитиноловые стенты и механические устройства вспомогательного кровообращения. EPCs выделяют путем посева фракции мононуклеарных клеток свиной крови, и обычно они появляются примерно через семь дней.

Их можно узнать по типичной морфологии, напоминающей «булыжную мостовую». Доведите число культивируемых EPC до общего количества 9 миллионов клеток. Промойте подготовленные EPC дважды в безсывороточной среде, стараясь ограничить их воздействие света во время и после маркирования.

Затем пометьте клетки флуоресцентной меткой PKH 26 и зафиксируйте объем внесенного раствора. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение четырех минут. Через одну минуту остановите реакцию окрашивания, добавив к раствору красителя равный объем свиной сыворотки.

Разбавьте объединенные растворы в соотношении один к одному полной ростовой средой. Затем аспирируйте жидкость и трижды промойте клетки полной ростовой средой, после чего проведите две промывки с использованием DPBS без хлорида кальция и магния. Далее покройте клетки трипсином, зафиксировав использованный объем, и инкубируйте их при 37 °C.

После трех минут инкубации с помощью микроскопии убедитесь, что клетки открепились; если это так, добавьте раствор для нейтрализации трипсина в объеме, в два раза превышающем объем добавленного трипсина. Объедините клеточные суспензии в одну пробирку и измерьте плотность клеток с помощью гемоцитометра. Наконец, осадите клеточную суспензию путем центрифугирования и ресуспендируйте клетки минимум в 4.5 миллилитрах безсывороточной среды.

После подготовки свиньи к операции сделайте разрез по срединной линии скальпелем с лезвием № 15, начиная от второй пары молочных желез. Осторожно продвигайтесь в направлении предпоследней пары желез, используя электрокоагулятор. Выполните диссекцию до уровня фасции брюшной стенки.

Приподнимите брюшину зажимом-москитом и осторожно рассеките ее ножницами Метценбаума, выведите мочевой пузырь наружу и наложите в стенку пузыря круговой шов нитью Vicryl 3-0. Сделайте точечный разрез в центре шва и введите в разрез катетер Фолея 16 Fr. Затем введите внутривенные растворы для поддержания диуреза на уровне не менее 1 мл/кг/час в течение всей операции.

Затем выведите наружу небольшой расширенный отдел кишечника и установите два хирургических ретрактора Бура, чтобы открыть заднюю часть брюшной полости, и идентифицируйте нижнюю полостую вену (НПВ) с помощью острого и тупого расслоения. Осторожно освободите НПВ от окружающих тканей. Затем проведите скелетизацию сосуда от правой почечной артерии проксимально до бифуркации НПВ дистально.

При диссекции нижней полой вены (НПВ) следует соблюдать крайнюю осторожность, так как даже очень небольшой дефект в НПВ может привести к стремительному кровотечению и обескровливанию животного. Перевяжите все боковые ветви сегмента НПВ; особое внимание уделите диссекции и лигированию двух крупных задних поясничных вен непосредственно проксимальнее бифуркации НПВ. Сзади часто располагается крупная поясничная вена.

Аккуратно выделите эту вену и зафиксируйте ее с помощью сосудистых петель. Теперь, параллельно с ходом операции, перед началом данной процедуры приступите к засеву имплантата EPC. Скаффолды для размещения тканей в титановой трубке должны быть полностью собраны и готовы к использованию в стерильной зоне.

Откройте газостерилизованный титановый трубный узел в шприце объемом 5 мл. Затем извлеките поршень из шприца объемом 5 мл, но не утилизируйте его. Плотно закройте шприц колпачком. Используйте пипетку, чтобы заполнить шприц суспензией EPC.

Затем установите поршень на место. Снимите колпачок и вставьте конец шприца с приманкой в открытую силиконовую трубку сборки до плотного прилегания. Затем медленно продвигайте раствор для клеток, пока он не достигнет верхней части головки, чтобы удалить все пузырьки воздуха.

Затем закройте устройство колпачком для люэра и загерметизируйте его лентой, работая в стерильных перчатках. Поместите всю эту сборку в специальный держатель для шприца и установите в инкубатор при температуре 37 °C. С помощью уровня убедитесь, что камеры для осаждения расположены горизонтально, и оставьте сборку инкубироваться при медленном вращении.

Продолжите операцию сразу после лигирования НПВ, введя 100 единиц гепарина на килограмм массы свиньи. Затем немедленно зажмите НПВ зажимом под углом 45 градусов дистально на НПВ и поясничной вене, а затем проксимально. Далее, используя скальпель с лезвием № 11 и тупые ножницы, выполните продольную венотомию длиной четыре сантиметра между проксимальным и дистальным зажимами.

Удалите всю кровь из нижней полой вены (НПВ) и промойте ее внутренний просвет стерильным DPBS. Теперь введите в НПВ имплантат с клетками-предшественниками эндотелия (EPC) или контрольный образец из чистого металла, чтобы предотвратить высыхание клеток и удалить воздух. Заполните НПВ раствором DPBS с хлоридом кальция и хлоридом магния.

Затем ушейте венотомию непрерывным швом из пролена 4-0 и снимите один проксимальный зажим, чтобы удалить воздух из НПВ путем небольшого обратного кровотечения. После этого снимите дистальный зажим, чтобы зафиксировать имплантат на месте. Наложите удерживающий шов на трубку ПВХ, проходящую через стенку вены.

Ушейте фасцию с помощью OPDS на игле для компьютерной томографии. Ушейте подкожное пространство двумя нитями Vicryl непрерывным швом. Затем закройте кожу с помощью степлера.

Подкожно введите до 20 мл 0,25% Маркаина вдоль места разреза, затем наложите на рану марлевую салфетку и пленку Tegaderm для купирования боли. При необходимости подкожно введите флуниксин и оксимоرفон. Прекратите действие анестезии и, когда свинья проснется, верните ее в клетку на следующие семь дней.

Вводите atri каждые 24 часа в качестве антибиотикопрофилактики и убедитесь, что наложенный перед операцией пластырь с фентанилом остается закрепленным в течение трех дней. По истечении трех дней установленные титановые трубки-имплантаты были извлечены, и их внутренние поверхности были исследованы. При длине волны возбуждения 550 нанометров в другой трубке был обнаружен сплошной слой флуоресцентно меченых клеток.

Срезы клеток были дополнительно окрашены с использованием маркера адгезии тромбоцитов к эндотелиальным клеткам для визуализации границ клеток. В данной процедуре может быть использовано большое variety красителей. Для сравнения, незащищенный титановый трубчатый имплантат полностью окклюзируется в протромботической среде с низким сдвигом в нижней полой вене.

Как показано на изображениях A и C, титановая трубка с закрепленными клетками представлена на изображении B; в ней не образовалось тромбов после проведения нашей процедуры изоляции с использованием свиной крови. EPC появляются в культуре в среднем через семь дней. При выполнении хирургической процедуры крайне важно осторожно и аккуратно скелетизировать НПВ, так как даже самый маленький разрыв НПВ или его боковых ветвей может привести к обескровливанию свиньи. После этой процедуры другие материалы, контактирующие с кровью, могут быстро эндотелизироваться для предотвращения тромбоза.

Эндотелиальные сосудистые стенты, например, с использованием наших EPC, имитируют естественную выстилку стенки кровеносного сосуда и могут предотвратить рестеноз и тромбоз стента после его установки. Наша технология быстрого нанесения позволит выстилать внутрисосудистые устройства эндотелиальными клетками-предшественниками, полученными из крови самого пациента, за несколько минут прямо в операционной или рентгеноперационной. Таким образом, исключается необходимость длительного культивирования ex vivo.

Время пребывания пациента на самом устройстве сокращается, что делает технологию пригодной для внедрения в клиническую практику.