Экспериментальные Генерация Карцинома-Associated Фибробласты (CAFS) из молочной железы человека Фибробласты

В данном видео описывается процедура получения карцинома-ассоциированных фибробластов (CAFs) из первичных культур человека. Карциномы фибробластов представляют собой сложные ткани, состоящие из неопластических клеток и неракового компонента, называемого стромой. Опухоль-ассоциированная строма состоит из внеклеточного матрикса и различных стромальных клеток, включая фибробласты, миофибробласты, эндотелиальные клетки, перициты и лейкоциты; карцинома-ассоциированные фибробласты богаты миофибробластами, что является характерным признаком активированных фибробластов, присутствующих внутри опухоли.

Стромальные клетки играют важную роль в прогрессировании опухоли. Их можно получить in vitro, предварительно выделив первичные фибробласты молочной железы человека из здоровой ткани груди, полученной в ходе редукционной маммопластики. Полученную ткань диссоциируют до получения суспензии единичных клеток, затем иммортализуют путем вирусной трансдукции и модифицируют для экспрессии GFP и гена устойчивости к пуромицину.

Затем клетки совместно с клетками карциномы молочной железы человека MCF-7 вводят подкожно иммунодефицитной мыши. Введенные фибробласты памяти человека трансформируются в стимулирующие развитие опухоли CAF-миофибробласты.

Затем родительские фибробласты молочной железы человека извлекают из ксенографтов опухоли и культивируют в присутствии пуромицина. Полученные пуромицин-резистентные клетки называют экспериментально генерируемыми CAF (exp CAF). Иммуногистохимический анализ показывает, что изначально присутствовавшие нормальные фибробласты молочной железы человека в составе ксенографта опухоли превращаются в CAF-миофибробласты, которые приобрели способность стимулировать турмогенез. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как выделение первичных CAF из тканей пациентов с раком молочной железы, является возможность экспериментального получения CAF из фибробластов молочной железы человека с использованием метода совместной имплантации опухоли.

В качестве общих моделей для демонстрации процедуры выступят Кар, постдок моей лаборатории, и Ахмед Кар, аспирант лаборатории. Начните с одного грамма здоровой ткани молочной железы человека, извлеченной в ходе редукционной маммопластики. Несколько раз промойте ткань в PBS, затем поместите ее в чашку Петри диаметром 15 сантиметров и с помощью стерильного лезвия измельчите на мелкие фрагменты размером менее 1,5 мм³.

Затем с помощью лезвия бритвы перенесите фрагменты ткани в коническую пробирку объемом 15 milliliter, содержащую 10 milliliters буфера для диссоциации клеток на каждые полграмма ткани. После этого перемешайте содержимое на вортексе в течение одной минуты на максимальной скорости. Поместите пробирку на шейкер-платформу в инкубатор при 37 degree Celsius и оставьте фрагменты ткани для переваривания на 12–18 часов.

На следующий день в пробирке после перемешивания на вортексе всё еще будет оставаться много фрагментов непереваренных тканей. Сначала перемешайте содержимое на максимальной скорости, затем поставьте пробирку на стол и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре без перемешивания. После инкубации с помощью пятимиллилитровой физиологической пипетки перенесите полученный супернатант, обогащенный стромальными клетками, в новую коническую пробирку.

Затем центрифугируйте стромальную фракцию в течение пяти минут при 250 ×g. После центрифугирования ресуспендируйте осадок клеток в PBS, затем снова центрифугируйте в течение пяти минут при 250 ×g. После этого ресуспендируйте осадок в среде DMEM с добавлением 10% FCS и перенесите клетки в чашку Петри диаметром 15 см.

Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% carbon dioxide. Через восемь-десять дней клетки должны достичь конфлюэнтности. На этом этапе клетки собирают, после чего их можно заморозить для длительного хранения.

Для иммортализации выделенных первичных нормальных фибробластов памяти человека введите ретровирусный вектор P MIG, экспрессирующий H turt и GFP; культивируйте клетки в течение четырех-пяти дней, после чего отберите GFP-положительные клетки с помощью проточной цитометрии. Введите ретровирусную конструкцию P babe puro, кодирующую ген устойчивости кピューромицину, в культуру GFP-помеченных иммортализованных фибробластов. Культивируйте клетки от пяти до семи дней в присутствииピューромицина в конечной концентрации 1 µg/mL.

Для выделения иммортализованных фибробластов памяти человека, помеченных GFP и устойчивых к пуромицину. Далее необходимо проверить, продуцируют ли фибробласты активные вирусы, которые могут привести к горизонтальному переносу генов, кодирующих GFP и устойчивость к пуромицину. Культивируйте 2,5 × 10⁵ иммортализованных фибробластов памяти человека, устойчивых к пуромицину, в чашке Петри диаметром 6 см в течение двух дней.

Соберите кондиционированную среду фибробластов и профильтруйте её с помощью шприцевого фильтра с размером пор 0.45 micron. Затем добавьте её к клеткам фибробластов мыши и культивируйте в течение 12 часов в присутствии 5 µg/mL полисульфата, который повышает эффективность вирусного заражения. По истечении 12 часов замените среду на DMEM с добавлением 10% FCS и культивируйте еще два дня.

Изучите клетки с помощью флуоресцентной микроскопии. 10 T и примерно половина клеток, инфицированных вирусом GFP, будут GFP-положительными. Теперь замените среду, чтобы обработать клетки в концентрации 1 µg/mL.

Инкубируйте с пуромицином от пяти до семи дней. Снова исследуйте клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы определить, образовали ли колонии какие-либо пуромицин-резистентные клетки. Обратите внимание, что горизонтальный перенос генов посредством активных вирусов, продуцируемых родительскими пуромицин-резистентными GFP-маркированными фибробластами молочной железы человека, может сделать окружающие пуромицин-чувствительные мышиные клетки и клетки карциномы резистентными.

Резистентность к пуромицину и экспрессия GFP внутри опухолевого ксенографта. Это может затруднить процесс выделения введенных меченных GFP пуромицин-резистентных фибробластов молочной железы человека из опухолевого ксенографта для экспериментального получения ассоциированных с карциномой фибробластов с целью последующего введения иммунодефицитной мыши. Начните с трипсинизации и подсчета только что подготовленной линии клеток молочной железы человека, а также линии клеток карциномы молочной железы человека MCF7-RAS в новых микроцентрифужных пробирках.

Ресуспендируйте 1×10⁶ клеток карциномы молочной железы человека MCF7 и 3×10⁶ бессмертных фибробластов молочной железы человека, меченных GFP и устойчивых к пуромицину, в 400 мкл культурной среды с 50% Matrigel на одну инъекцию. Поместите пробирки на лед в качестве контроля.

Также подготовьте такие же фибробласты молочной железы человека без клеток MCF seven RAs. Затем с помощью иглы 27-го калибра введите смесь клеток в подкожную область иммунодефицитной мыши линии nude, чтобы изучить внутриопухолевую вариабельность фенотипов calfs. Выделите calfs и контрольные фибробласты из нескольких различных опухолевых ксенографтов.

Затем имплантируйте каждую смесь в правый и левый бока каждой мыши. Дайте ксенографтам опухоли или фибробластов расти в течение 42 дней после инъекции. Период инкубации фибробластов внутри ксенографта опухоли следует оптимизировать исходя из фенотипа миофибробластов, приобретаемого родительскими фибробластами в опухоли.

Для выделения фибробластов из ксенографта или контрольных фибробластов эвтаназированной мыши поместите не менее 0,5 г ткани ксенографта и не менее 0,1 г ткани ксенографта с фибробластами в отдельные чашки. Затем с помощью стерильного лезвия измельчите ткань на мелкие фрагменты размером менее 1,5 мм³. После этого с помощью лезвия перенесите фрагменты ткани в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую буфер для диссоциации клеток, и перемешайте на вортексе в течение одной минуты на максимальной скорости. Инкубируйте клеточную суспензию в течение трех часов при 37 °C при постоянном медленном перемешивании, затем центрифугируйте клеточную суспензию.

Диссоциируйте либо опухолевый, либо фиброзный сано-графт в течение пяти минут при центрифугировании с ускорением 250 ×g. Ресуспендируйте осадок клеток в PBS и повторите центрифугирование. Затем ресуспендируйте полученный осадок клеток в среде DMEM с добавлением 10% FCS для выделения культуры родительских фибробластов молочной железы человека, устойчивых кピューрамицину.

Клетки, полученные из опухоли или фибробласты, культивируют в чашке Петри диаметром 15 см в присутствии 1 µg/mL пурамицина при 37 °C и 5% CO2. Это позволит устранить любые contaminating carcinoma cells и/или мышиные клетки.

Культивируйте стромальные клетки до достижения конфлюэнтности, затем заморозьте их при температуре -80 °C, используя среду для заморозки. Обратите внимание, что полученные устойчивые к пуромицину клетки, обозначенные как 42-day old XP calf one или control fibroblast one, являются иммортализованными и GFP-положительными. Фибробласты памяти человека усиливают свой опухоле-продуцирующий миофибробластический фенотип внутри ксенографта опухоли, взаимодействуя с клетками карциномы в процессе прогрессирования опухоли. Смешайте 1 × 10⁶ клеток MCF seven RA и 3 × 10⁶ клеток 42-day old P calf.

Перенесите клетки в 400 µL культурной среды с 50% Matrigel в эпиндорф-пробирку объемом 1,5 мл для последующего введения. Также подготовьте в эпиндорф-пробирке контрольные фибробласты 42-дневного возраста в количестве 3 × 10⁶ клеток без добавления клеток карциномы для дальнейшего усиления опухолестимулирующих миофибробластных фенотипов эксплантатов. Смешайте эти клетки с клетками CF seven RAs и введите полученную смесь подкожно обнаженной мыши. Кроме того, введите только контрольные фибробласты без раковых клеток для подготовки контрольной группы, если это необходимо.

Инкубируйте клетки exp calf one в течение дополнительных 200 дней в опухолевом ксенографте для получения клеток exp C two с целью усиления опухолестимулирующего миофибробластического фенотипа. Также получите контрольные клетки Fibroblasts two в качестве контроля для клеток exp calf two, введя контрольные клетки fibroblasts one без клеток карциномы мыши, после чего удалите опухоли и поместите их в чашки для культивирования тканей.

Проведите диссекцию и диссоциацию опухоли или синотрансплантата фибробластов до получения суспензии одиночных клеток и поместите их в культуру. Культивируйте клетки в чашке Петри диаметром 15 см в среде 10% F-C-S-D-M-E-M с добавлением пуромицина до достижения конфлюэнтности, затем трипсинизируйте и криоконсервируйте клетки при температуре -80 °C, используя среду для замораживания. Полученные устойчивые к пуромицину клетки названы клетками 242-дневного эксп. теленка 2 или контрольными клетками фибробластов 2. Клетки GFP-меченых эксп. теленка 2 и контрольные клетки фибробластов 2, выделенные из ксенотрансплантатов опухоли молочной железы, были проанализированы иммуногистохимически; как показано на данном изображении, клетки демонстрируют сильную положительную экспрессию мезенхимальных маркеров, включая специфичные для человека пролил-4-гидроксилазу, коллаген 1A, фибронектин, S 100, A4 и поверхностный белок фибробластов.

Эти результаты указывают на человеческое происхождение и мезенхимальную природу данных клеток. Напротив, окрашивание на цитокератин — маркер эпителиальных клеток — в совокупности с этими GFP-положительными фибробластами не проявилось. Эти данные позволяют предположить, что клетки EXP C two и контрольные фибробласты two произошли от родительских фибробластов молочной железы человека, которые изначально были введены в мышиные ксенографты.

Важно отметить, что значительно большее количество клеток XP calf two окрасилось положительно на alpha SMA и гликопротеин внеклеточного матрикса to nasin C, которые являются маркерами миофибробластов, по сравнению с контрольными клетками фибробластов two. Заметим, что в клетках exp calf two присутствует более высокая доля alpha smma-положительных миофибробластов по сравнению с той, что наблюдалась в клетках exp calf one в возрасте 42 дней. Эти данные демонстрируют, что резидентные фибробласты памяти человека постепенно превращаются в миофибробласты calf в опухолевых ксенографтах по мере прогрессирования опухоли после ее развития.

Модель ксенографта опухоли с комплементацией открыла исследователям микроокружения опухоли путь к изучению процессов превращения нормальных фибробластов в раковые. Так говорят о фибробластах.