Визуализация эстрогеновых рецепторов-α в Крыса пиальных Артериолы использованием цифровой микроскоп иммунофлуоресцентного

Общая цель данной процедуры — описать простой метод оптимизации окрашивания и визуализации рецептора эстрогена альфа с использованием поперечных срезов артерий коры, полученных из головного мозга самок крыс. Это достигается путем предварительного удаления окрашенных красителем Эванса артерий с поверхности мозга с последующим разрезанием их на кольца толщиной восемь микрон с помощью криостата. Поперечные срезы наносятся на предметные стекла и инкубируются с первичными антителами к рецептору эстрогена альфа.

Затем срезы инкубируют со вторичным антителом и контркрасителем с использованием среды для заключения, содержащей dpi. Наконец, флуоресцентно меченые сегменты сосудов кожуры визуализируют и преобразуют в 2D-изображения с помощью программного обеспечения для расширенного фокуса по глубине. В итоге, с помощью иммунофлуоресцентного микроскопа Nikon с программным обеспечением для расширенной глубины фокуса можно получить результаты, демонстрирующие экспрессию рецептора эстрогена альфа в артериолах кожуры.

Меня зовут доктор Маргерит Литтлтон Кирни. Сегодня доктор Нил Фарани, постдокторант моей лаборатории, продемонстрирует простую процедуру по оптимизации визуализации и окрашивания рецептора эстрогена альфа в эпителии.

Артерии головного мозга крысы, перфузированного красителем Эванса и хранившегося при температуре минус 70 °C. С помощью диссекционного микроскопа идентифицируйте поверхностные артерии на поверхности мозга и удалите их, используя тонкогубчатый пинцет. Тщательно удалите любые прилипшие ткани мозга.

Поместите артерии в небольшую пробирку на льду. Фиксируйте артерии в 2% холодном порошковом формальдегиде в 0.1 mole PBS в течение 30 минут. Для подготовки артерий к секционированию налейте среду для заливки на криодиск, установленный при температуре minus 20 degrees Celsius.

Положите участок артерии плоско на охлаждающий блок и дождитесь его замораживания. После того как образец плотно замерзнет, поместите артерию вертикально в среду для заливки на замораживающий диск криостата. Убедитесь, что кончик артерии направлен вперед.

Удерживайте артерию пинцетом до полного ее замораживания. Поместите диск для замораживания с артерией в головку криостата, затем сделайте срезы артериальных колец толщиной восемь микрон непосредственно на предметное стекло. Закрепите срезы артерии на хромово-калиевом желатине.

Разгладьте препараты на предметных стеклах, используя две кисти, чтобы выпрямить артериальные кольца. Храните подготовленные стекла в кассете для предметных стекол в холодильнике при температуре четырех градусов Цельсия в течение ночи. Извлеките стекла из холодильника и выдержите их на лабораторном столе до достижения комнатной температуры.

Промойте предметные стекла 1–1,5 мл 0,1 М PBS. Через 10 минут слейте PBS и повторите процедуру еще дважды. После финальной промывки PBS инкубируйте предметные стекла в 1 мл 50 мМ хлорида аммония в течение 30 минут при комнатной температуре. Для снижения эндогенной флуоресценции промойте предметные стекла 0,1 М PBS 3 раза по 10 минут, как описано ранее. Затем заблокируйте предметные стекла в растворе PBS, содержащем 0,1% Triton X 100 и 1% нормальной сыворотки козы, в течение 30 минут для снижения неспецифического связывания первичных антител.

После блокировки инкубируйте предметные стекла с первичными антителами к ER alpha, разведенными в блокирующем растворе в концентрации 1:500, в течение ночи при температуре 4 °C. Достаньте стекла из холодильника и доведите их до комнатной температуры. Удалите несвязанные первичные антитела, промыв стекла 1–1,5 мл 0,1% PBS 3 раза по 10 минут.

Каждый раз инкубируйте предметные стекла с вторичными антителами против кролика Oregon Green 488 в блокирующем растворе в течение двух часов в темноте при комнатной температуре; после инкубации промойте стекла в 0,1 M PBS 3 раза по 10 минут на каждую промывку, а затем перенесите их в вытяжной шкаф. Нанесите каплю среды для заключения, содержащей DAPI, на образцы, а затем накройте образец покровным стеклом. Нанесите бесцветный лак для ногтей, чтобы загерметизировать края покровного стекла, и дайте ему полностью высохнуть.

Поместите подготовленные предметные стекла с окрашенными сегментами сосудов под микроскоп и настройте прибор для визуализации флуоресцентно-меченных интересующих областей. Визуализация окрашенного ER alpha является самым сложным этапом данной процедуры. Найдите такой уровень среза сосуда, где рецепторы видны наиболее четко.

Начните с 100-кратного увеличения, затем увеличьте его до 600-кратного. С помощью камеры сделайте снимки в каналах DPI и ZI для ядер клеток и ER alpha соответственно, а затем используйте программное обеспечение для преобразования нескольких видов сегментов сосудов в 2D-изображения. Здесь представлены результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на ER alpha (зеленый цвет) и контрастного окрашивания DPI.

На синем фоне в кольце вырезанной артерии, изолированной из мозга самки крысы, совмещенные изображения указывают на наличие внутриядерного эстрогенового рецептора альфа. С помощью комбинации Z-стековых изображений можно получить сфокусированное изображение иммунофлуоресценции ER альфа; для учета автофлуоресценции следует провести отрицательный контроль как для первичных, так и для вторичных антител. Обратите внимание на выраженную автофлуоресценцию вдоль эндотелиальной стороны артерии, которая не инкубировалась с вторичными антителами.

После просмотра этого видео вы должны понять, как изолировать и отделять артерии от поверхности мозга, а также как подготавливать поперечные срезы колец толщиной восемь микрон. Кроме того, вы должны ознакомиться с методом использования флуоресцентно меченных рецепторов эстрогена альфа и визуализацией рецепторов с помощью цифрового иммунофлуоресцентного микроскопа и соответствующего программного обеспечения Nikon extended.