Трехмерная визуализация иммуномеченых астроцитов с помощью конфокальной микроскопии

Возьмите иммуноокрашенный срез мозга мыши с флуоресцентно мечеными астроцитами. Цитоплазма астроцита флуоресцирует красным цветом, в то время как ядро флуоресцирует синим.

Поместите предметное стекло на предметный столик конфокального микроскопа под подходящую линзу объектива.

С помощью программного обеспечения для сбора данных отрегулируйте фокус и выберите флуорофоры, обозначающие цитоплазму и ядро астроцита.

Начните визуализацию в реальном времени и оптимизируйте параметры визуализации для снижения шума на полученном изображении.

В разделе Параметры сбора данных выберите режим сканирования с низкой скоростью для получения двухмерного изображения более высокого качества.

Определите самое верхнее положение астроцита в качестве начальной точки для Z-стека и нижнее положение в качестве конечной точки.

Определите количество срезов, покрывающих всю глубину ячейки.

Объедините срезы, чтобы создать трехмерное изображение астроцита.

Чтобы начать конфокальную микроскопию, поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа и выберите объектив 63x. После открытия программного обеспечения для сбора данных нажмите «Умная настройка» на вкладке «Сбор» и выберите подходящие флуорофоры. Здесь используются DAPI и Alexa Fluor 555.

Затем нажмите на «Лучший сигнал», а затем «Применить». Затем нажмите «Установить экспозицию», чтобы позволить компьютеру определить оптимальные параметры экспозиции.

Чтобы оптимизировать изображение, откройте окно «Каналы» и переключите изображение в режим «Live». При необходимости отрегулируйте фокус. Затем нажмите на 1 а.е., чтобы оптимизировать отверстие. Отрегулируйте усиление для достижения наилучшей интенсивности.

Наконец, установите цифровое усиление в диапазоне от 2 до 3. После этой оптимизации остановите изображение в реальном времени и откройте окно Acquisition Mode. Отрегулируйте размер кадра, нажав на X по Y, и выберите 1024 по 1024. Кроме того, выбирайте медленную скорость.

Далее откройте вкладку Усреднение и выберите число больше или равное 4. Затем нажмите кнопку «Привязать» и сохраните захваченное 2D-изображение. Чтобы настроить 3D-изображение, откройте вкладку «Умная настройка» и отметьте пункт Z-Stack, что приведет к открытию окна стека.

Чтобы установить первое и последнее положение для Z-Stack, снова нажмите кнопку Live и установите фокус на самую верхнюю позицию астроцита. Нажмите «Установить первым». Теперь отрегулируйте фокус на самое нижнее положение астроцита и нажмите на Установить последним. Затем остановите просмотр в реальном времени.

Далее выберите интервал, нажав на кнопку «Оптимальный», чтобы задать количество срезов. Здесь интервал составляет 1,01 микрометра. Наконец, нажмите «Начать эксперимент» и сохраните изображения после завершения сканирования.