JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:00 мин • June 17th, 2025
Возьмите химически закрепленный срез мозга мыши в многолуночной пластине.
Ткань содержит аксоны, окруженные богатыми липидами миелиновыми оболочками. Тела клеток содержат тельца Ниссля, состоящие из шероховатого эндоплазматического ретикулума и рибосом.
Инкубировать в растворе для пермеабилизации, содержащем флуоресцентный краситель по Нисслю. Раствор проникает в клеточные мембраны, позволяя красителю связываться с рибосомальной РНК в тельцах Ниссля и помечать клеточные тела.
Поместите ткань под конфокальный микроскоп с помощью когерентной антистоксовской рамановской спектроскопии (CARS).
Прямая синхронизированная накачка и лазерные лучи Стокса на ткани, настроенные на возбуждение молекулярных связей в богатой липидами миелиновой оболочке.
Введите зондовый лазерный луч для взаимодействия с возбужденными связями и получения антистоксового сигнала, специфичного для миелина.
Фотодетектор улавливает сигнал для создания изображения, специфичного для миелина.
Используйте конфокальную визуализацию для захвата сигналов от помеченных тел Ниссля.
Наложение конфокальных изображений и изображений CARS для визуализации нейронной архитектуры.
После подготовки тканей, как описано в рукописи, окрасьте свободно плавающие срезы для Ниссля и антител для визуализации клеточных тел. Затем инкубируйте секции на стандартном лабораторном шейкере в течение 30 минут при комнатной температуре. Перед тем, как поднести образцы к микроскопу, включите и прогрейте лазер CARS не менее одного часа. Затем выровняйте лазер CARS, пространственно перекрывая лазерные лучи накачки и Стокса, и отрегулируйте задержку между двумя лазерными лучами.
Конденсорная оптика Колера и диафрагма микроскопа для прямой визуализации CARS. Затем отрегулируйте внешний перископ так, чтобы центрировать пространственно перекрывающиеся два лазера на зеркалах сканирующей головки микроскопа. Для наилучшего обнаружения прямого CARS без сканирования убедитесь, что конденсатор защищен.
Для иммунофлуоресцентной конфокальной визуализации и визуализации CARS установите на лазер CARS как прямые, так и эпи-CARS недесканированные детекторы, добавив конфокальный микроскоп, оснащенный видимыми лазерами для флуоресцентной визуализации. Теперь поместите срезы в чашку для культивирования с покровным дном и PBS, чтобы избежать пересыхания ткани. Кроме того, используйте стеклянный грузик, чтобы держать салфетку рядом с покровным стеклом.
Использование графического пользовательского интерфейса. Задайте параметры получения изображений для флуоресцентной конфокальной визуализации CARS и Nissl. Поместите образец на предметный столик микроскопа. Сфокусируйте образец и сделайте снимок.