Визуализация белков и макромолекулярных комплексов по Отрицательные пятна EM: от сетки Подготовка к Image Acquisition
22 декабря 2011 г.
Визуализация белка образцы отрицательной окраски электронной микроскопии (ЭМ) стала популярным методом структурного анализа. Это полезно для количественного структурного анализа, таких, как расчет 3D-реконструкции исследуемых молекул, а также для качественной проверки качества белковых препаратов. В этой статье мы приводим подробные протоколы для подготовки EM сетки, окрашивание образца и визуализации образца в электронном микроскопе. Начинающие пользователи могут следующие протоколы легко и использовать отрицательную окраску EM в качестве рутинного анализа, в дополнение к другим биохимические анализы, для оценки их образцы белка.
Общая цель данной процедуры заключается в визуализации очищенных образцов белка с помощью электронной микроскопии с негативным контрастированием. Для этого сначала подготавливаются сетки для электронной микроскопии, на которые будет нанесен образец. Вторым этапом процедуры является приготовление раствора для негативного контрастирования.
Затем образец наносят на сетку для электронной микроскопии и подвергают негативному контрастированию. В завершение сетку для ЭМ помещают в электронный микроскоп и делают снимки при соответствующих оптических условиях. Традиционные ПЭМ-изображения в светлом поле обладают высоким контрастом и четкой детализацией, демонстрируя отдельные макромолекулы, распределенные по однородному фону.
Электронная микроскопия с негативным контрастированием представляет собой простой метод визуализации исследуемого белка. Этот метод может использоваться в качестве рутинного анализа для изучения очищенного белка, как для структурного анализа, так и для других биохимических и биофизических исследований. В данном материале мы демонстрируем способ подготовки образца с негативным контрастированием для электронной микроскопии.
Визуальная демонстрация данного метода будет полезной, так как некоторые этапы трудно освоить по текстовым описаниям и рисункам. Начните с того, что с помощью стеклянной пипетки нанесите одну каплю коллодия на поверхность воды в большом стакане. По мере растекания коллодий может захватывать частицы пыли с поверхности воды.
Удалите запылившуюся пленку из коллодийного пластика и замените ее новой каплей. Затем поочередно поместите от 50 до 100 сеток для ПЭМ на плавающую пластиковую пленку блестящей стороной вниз. Для стандартного негативного контрастирования используйте сетки с размером ячейки 400 mesh, а также сетки 200 mesh.
Для сбора изображений пар с наклоном. Выберите кусочек неразглаженной бумаги с низкой впитывающей способностью, размер которой немного превышает площадь сеток. Положите бумагу поверх сеток и подождите, пока она полностью не промокнет.
Бумага не должна впитывать воду слишком быстро. Мы используем бумагу из дешевого блокнота. Теперь сетки зажаты между пластиковой пленкой и бумагой.
С помощью пинцета поместите бумагу в чашку Петри для медленного высыхания на воздухе. Избегайте методов ускоренной сушки, так как они могут привести к образованию складок. В нашей лаборатории используется установка для напыления углерода Creston 2 0 8 C high vacuum turbo carbon coer.
Установка оснащена монитором толщины пленки Creston. В мониторе используется кварцевый баланс, чувствительный к углеродным отложениям. Однако протокол, описанный здесь, не требует использования этого устройства. Начните с заточки и загрузки углеродных стержней в установку для углеродного напыления.
Затем нанесите вакуумную смазку на предметное стекло, оставив половину матовой области незакрашенной. После напыления углерода смазанные участки стекла используются для оценки толщины углеродного слоя. Поместите бумагу с сетками на предметный столик под колпак установки для напыления углерода. Разместите смазанное стекло.
Сдвиньте образец к сеткам. Окачайте вакуумную камеру до достижения давления не менее 10 micro tours, иначе из-за искрения в сетке образуется множество крупных частиц. Теперь очень медленно увеличивайте ток.
Острый кончик угольного стержня станет чрезвычайно ярким. Не смотрите на него невооруженным глазом во время начала напыления; по мере нарастания углеродного слоя стеклянный предметный slides изменит цвет на темно-серый. Отключите ток при достижении желаемой толщины углерода, учитывая прозрачность колокола. После того как степень затемнения предметного стекла будет откалибрована в соответствии с толщиной углерода, данный метод станет таким же точным, как и использование более дорогого монитора толщины пленки.
По окончании процесса выпустите вакуум из камеры и извлеките покрытые сетки для последующего использования. Тонкий пластиковый слой не повлияет на качество изображения при негативном контрастировании, но его можно удалить, выдержав сетки в хлороформе в течение нескольких часов перед началом работы. Приготовьте свежий раствор уранил-формата или используйте раствор, который хранился в темноте не более двух недель.
Качественный свежеприготовленный раствор имеет желтый цвет, значение pH около четырех и является очень чистым, без осадка. Начните с использования имеющейся в продаже системы для 글로у-разряда. Выполните 글로у-разряд сеток с углеродным покрытием.
Затем нанесите две капли дистиллированной воды по 20 µL и две капли свежего раствора формата мочи по 25 µL на кусочек парафильма. С помощью антикапиллярного пинцета с обратным усилием удерживайте сетку, прошедшую разряд свечения, повернув сторону с углеродным покрытием вверх. Важно, что такие пинцеты не всасывают жидкость из сеток.
Теперь нанесите 2 µL образца белка на сетку и подождите, пока белки адсорбируются на поверхности сетки. Обычно это занимает 30 секунд, однако для очень разбавленных образцов потребуется больше времени, что может повлиять на концентрацию буфера. По завершении удалите излишки образца белка с помощью фильтровальной бумаги.
Затем промойте сетку дважды, кратковременно прикоснувшись ее поверхностью к капле воды и промакнув ее насухо через несколько секунд. После воздействия воды таким же образом прикоснитесь сеткой к капле красителя и быстро промокните ее насухо. Используя ту же технику, оставьте сетку в контакте со второй каплей красителя на 20 секунд.
Наконец, высушите сетку на воздухе в вытяжном шкафу или, что предпочтительнее, в вакууме перед сессией ПЭМ; проверьте юстировку ПЭМ-микроскопа, загрузив файл оптимальной юстировки, если таковой имеется, что должно вернуть прибор в состояние, близкое к идеальному. Теперь поместите ПЭМ-сетку в стандартный держатель образцов с одноосевым наклоном. Затем вставьте держатель в предметный столик.
Затем дождитесь завершения цикла перекачки и вставьте держатель в колонку. Теперь начните поиск области образца с интенсивным окрашиванием. Выполните фокусировку вручную методом минимального контраста или с помощью камеры CC, D, вычисляя живое значение four.
Ваш энергетический спектр. Затем установите глубокий фокус по мере необходимости, обычно на -1,5 мкм. Концентрация красителя может варьироваться по всей сетке, поэтому ищите белки с белым контрастом.
Избегайте участков с неравномерным окрашиванием или положительным окрашиванием, где контраст белка становится черным. Применяя описанный подход к подготовке сеток и визуализации образцов с негативным окрашиванием, для демонстрации были получены изображения нескольких известных белков.
Обратите внимание на их детализацию и резкий контраст. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как подготавливать образцы макромолекул с использованием метода негативного окрашивания для наблюдения в электронном микроскопе. При наличии соответствующего навыка выполнение данной методики занимает около четырех часов.
После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как 3D-реконструкция, для более детального изучения молекулярных структур.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол визуализации очищенных образцов белков с помощью электронной микроскопии (ЭМ) с негативным контрастированием. Этот метод доступен для начинающих пользователей и служит стандартным анализом для структурного исследования белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Структурная биология
- Электронная микроскопия
- Анализ белков
Введение
- Электронная микроскопия с негативным контрастированием является широко используемым методом визуализации белков.
- Она позволяет проводить как качественный, так и количественный структурный анализ.
- Протоколы подготовки образцов и визуализации имеют решающее значение для успешного применения метода.
- Данный метод может углубить понимание структур белков.
Цель исследования
- Предоставить подробное руководство по подготовке сеток для ЭМ и окрашиванию образцов.
- Продемонстрировать визуализацию белков с помощью ЭМ с негативным контрастированием.
- Способствовать повсеместному применению этого метода в анализе белков.
Используемые методы
- Подготовка сеток для электронной микроскопии.
- Нанесение раствора для негативного окрашивания на образцы белков.
- Визуализация образцов с помощью электронного микроскопа.
- Запись изображений при оптимальных условиях.
Основные результаты
- Были получены высококонтрастные изображения белков.
- Подробные протоколы были успешно продемонстрированы.
- Наглядные пособия улучшили понимание сложных этапов.
- Результаты подтверждают возможность использования метода негативного контрастирования в ЭМ для рутинного анализа белков.
Выводы
- Электронная микроскопия с негативным контрастированием является эффективным методом визуализации белков.
- Представленные протоколы просты в исполнении даже для начинающих пользователей.
- Данный метод может дополнять другие биохимические анализы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Электронная микроскопия (ЭМ) с негативным контрастированием обеспечивает быструю высококонтрастную визуализацию очищенных белков и макромолекулярных комплексов, что позволяет на ранних этапах оценить качество образца и состояние сборки. Данный метод помогает принимать критически важные решения о целесообразности дальнейшего проведения исследований в процессе разработки, подтверждая гомогенность образца и формирование комплекса перед ресурсоемкими последующими этапами анализа. Доступность и воспроизводимость делают этот метод базовым инструментом для групп структурной биологии в сфере биофармацевтических исследований и разработок (R&D).
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях&D
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую визуализировать белковые комплексы для подтверждения их сборки и целостности.
- Обеспечивает быструю оценку гомогенности образца, снижая неопределенность при валидации мишени.
- Способствует раннему обнаружению агрегации или деградации, снижая риски при последующих этапах рабочего процесса.
- Предоставляет визуальные доказательства для поддержки механистических гипотез при выборе мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подтвердить качество белковых препаратов перед проведением высокопроизводительного скрининга или разработкой анализа.
- Обеспечивает воспроизводимость и стандартизацию исходных образцов для количественных анализов.
- Обеспечивает масштабируемую подготовку валидированных сеток для ЭМ для многократного использования в кампаниях по скринингу.
- Способствует надежной оценке влияния соединений на структуру или сборку белков.
Трансляционные и доклинические исследования
- Подтверждает структурную целостность терапевтических кандидатов перед началом доклинических исследований.
- Сопоставляет визуальные данные с результатами биохимических и биофизических анализов для обеспечения трансляционной преемственности.
- Снижает риск перевода структурно нестабильных кандидатов на стадию доклинических моделей.
- Обеспечивает базовые данные для последующей 3D-реконструкции и изучения механизмов действия.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Электронная микроскопия с отрицательным контрастированием занимает промежуточное положение между очисткой белков и их структурной или функциональной характеристикой, связывая этап первичного поиска и доклинические исследования.
- Открывательная биология: поддержка проверки гипотез путем визуализации белковых комплексов и сборок.
- Скрининг: подтверждение качества и воспроизводимости образцов для последующих анализов.
- Аналитика: получение высококонтрастных изображений для количественной оценки гомогенности и агрегации образцов.
- Трансляционные исследования: обеспечение структурной целостности кандидатов, проходящих доклиническую валидацию.
- Корпоративное использование: предоставление стандартизированного рутинного анализа, адаптируемого под различные белковые мишени и проекты.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность в качестве образцов и валидации мишени.
- Операционная ценность: обеспечивает быстрые, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы визуализации.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение структурно валидированных кандидатов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке сеток для ЭМ и работе с оборудованием.
- Необходим доступ к инфраструктуре электронной микроскопии и реагентам для окрашивания.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости подготовки образцов и получения изображений.
- Применимо к широкому диапазону размеров белков и типов комплексов.
- Ограничено визуализацией поверхности; не подходит для анализа внутренней структуры с высоким разрешением.
