Визуализация белков и макромолекулярных комплексов по Отрицательные пятна EM: от сетки Подготовка к Image Acquisition
December 22nd, 2011
Визуализация белка образцы отрицательной окраски электронной микроскопии (ЭМ) стала популярным методом структурного анализа. Это полезно для количественного структурного анализа, таких, как расчет 3D-реконструкции исследуемых молекул, а также для качественной проверки качества белковых препаратов. В этой статье мы приводим подробные протоколы для подготовки EM сетки, окрашивание образца и визуализации образца в электронном микроскопе. Начинающие пользователи могут следующие протоколы легко и использовать отрицательную окраску EM в качестве рутинного анализа, в дополнение к другим биохимические анализы, для оценки их образцы белка.
Общая цель этой процедуры заключается в визуализации образцов очищенного белка с помощью электронной микроскопии с отрицательным окрашиванием. Это достигается путем предварительной подготовки сеток электронной микроскопии, которые будут поддерживать образец. Вторым этапом процедуры является приготовление раствора для негативного пятна.
Далее образец наносится на сетку электронной микроскопии и окрашивается негативно. Наконец, электромагнитная сетка загружается в электронный микроскоп, и изображения записываются в соответствующих оптических условиях. Обычные светлопольные изображения ЦМР отличаются высокой контрастностью и высокой детализацией, показывая одну макромолекулу, разбросанную по безликому фону.
Электронная микроскопия с отрицательным окрашиванием – это простой метод визуализации любимого белка. Его можно использовать в качестве рутинного анализа для исследования очищенного белка либо для структурного анализа, либо для других биохимических и биофизических анализов. Здесь мы покажем, как подготовить отрицательно окрашенный образец к электронной микроскопии.
Визуальная демонстрация этого метода полезна, так как некоторые шаги трудно узнать из текстовых описаний и рисунков. Начните с использования стеклянной пипетки, чтобы поместить одну каплю коллодия в большой стакан с водой на поверхности воды. По мере распространения коллодия он может захватывать пыль с поверхности воды.
Снимите и замените пыльную пленку коллодионного пластика другой каплей. Далее поместите от 50 до 100 ЭМ решеток одну за другой на плавающую пластиковую пленку блестящей стороной вниз. Выберите 400 сеток для обычного негативного окрашивания и выберите 200 сеток.
Для сбора изображений тилт-пар. Выберите на листе медленно впитывающей способности несмятую бумагу, площадь которой немного больше по площади сетки. Положите бумагу поверх сетки и подождите, пока бумага полностью намокнет.
Бумага не должна слишком быстро впитывать воду. Мы используем бумагу из дешевого блокнота. Теперь сетки зажаты между пластиковой пленкой и бумагой.
С помощью щипцов поместите бумагу в чашку Петри, чтобы она медленно высохла на воздухе. Избегайте более быстрых методов сушки, так как они могут привести к появлению складок. Машина для нанесения углеродных покрытий, используемая в нашей лаборатории, представляет собой высоковакуумный турбокарбоновый коер.
Оснащен толщиномером пленки Creston. В мониторе используются кварцевые весы, чувствительные к отложениям углерода. Однако описанный здесь протокол не требует устройства Начните с заточки и загрузки углеродных стержней в машину для нанесения углеродного покрытия.
Следующий слой, предметное стекло с вакуумной смазкой, оставляющее половину матовой области без покрытия После углеродного покрытия, смазанные участки предметного стекла используются для оценки толщины углеродного покрытия. Положите бумагу с сетками на сцену под колпак машины для нанесения углеродного покрытия. Установите смазанное маслом стекло.
Проведите пальцем рядом с сеткой. Накачивайте вакуумную камеру не менее чем на 10 микротуров, иначе искрообразование образования большого количества крупных частиц в сетке. Теперь увеличивайте ток очень медленно.
Острый кончик карбонового стержня станет чрезвычайно ярким. Не наблюдайте его невооруженным глазом, так как начинается нанесение покрытия, предметное стекло будет менять цвет на темно-серый по мере наращивания карбонового покрытия, режьте ток при нужной толщине углерода и учитывайте прозрачность колокольчика в банке. При вынесении этого суждения, после того как темнота предметного стекла откалибрована по толщине углерода, этот метод так же точен, как и более дорогой монитор толщины пленки.
Когда процесс будет завершен, проветрите вакуумную камеру и снимите решетки с покрытием для последующего использования. Тонкий слой пластика не повлияет на качество негативно окрашенного изображения, но его можно удалить, замочив сетки в хлороформе на несколько часов перед тем, как продолжить. Приготовьте свежий раствор формиата в мочеприемнике или используйте раствор, который хранился в темноте менее двух недель.
Хороший свежий раствор имеет желтый цвет, pH около четырех и работает очень чистым, без осадков. Начните с использования коммерчески доступной системы для свечения. Разгрузите решетки с углеродным покрытием.
Далее нанесите две капли по 20 микролитров дистиллированной воды и 2 капли по 25 микролитров свежего раствора формиата мочеприемника на кусочек перфила. С помощью антикапиллярных щипцов обратного действия держите светящуюся разряженную сетку углеродной облицовкой вверх. Важно отметить, что эти щипцы не выкачивают жидкость из сеток.
Теперь нанесите на сетку два микролитра образца белка и подождите, пока белки впитаются в сетку. Обычно это занимает 30 секунд, но для очень разбавленных образцов требуется больше времени, что может повлиять на буферные концентрации. Когда закончите, промокните образец белка фильтровальной бумагой.
Затем дважды промойте сетку, кратковременно коснувшись ее поверхности до капли воды, и промокните ее насухо в течение нескольких секунд. После вода ненадолго коснется сетки до капли пятна и быстро промокните ее насухо. Используя ту же технику, дайте сетке соприкоснуться со второй каплей пятна в течение 20 секунд.
Наконец, высушите сетку на воздухе на настольном вытяжном шкафу или, желательно в вакууме перед сеансом ЭМ, проверьте юстировку ЭМ-микроскопа, загрузив идеальный файл юстировки, если таковой имеется, восстановите его до почти идеального состояния. Теперь загрузите электромагнитную решетку на стандартный держатель образца с одним наклоном. Далее вставляем держатель в сцену.
Затем дождитесь завершения цикла откачки и вставьте держатель в колонку. Теперь начните поиск образца участка с хорошим окрашиванием. Сфокусируйтесь вручную с помощью метода минимальной контрастности или с помощью камеры CC, D и вычисления живой четверки.
Ваш спектр мощности. Затем установите глубокий фокус по мере необходимости, обычно на отрицательные 1,5 микрона. Концентрация красителя может варьироваться по всей сетке, поэтому ищите белки с белым контрастом.
Избегайте участков с неравномерным окрашиванием или положительным окрашиванием, где контраст белка становится черным. С помощью намеченного подхода делаем сетки и визуализируем негативно окрашенные образцы. Несколько знакомых белков были визуализированы в демонстрационных целях.
Обратите внимание на их детализацию и резкий контраст. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как генерировать образцы отрицательно окрашенных макромолекул для наблюдения в электронном микроскопе. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за четыре часа.
После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как 3D-реконструкция, чтобы лучше понять молекулярные структуры.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол визуализации очищенных образцов белков с использованием метода отрицательного окрашивания в электронной микроскопии (ЭМ). Метод доступен для начинающих пользователей и служит рутинным анализом для структурного исследования белков.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Структурная биология
- Электронная микроскопия
- Анализ белков
Предыстория
- Отрицательное окрашивание в ЭМ является широко используемой техникой для визуализации белков.
- Это позволяет проводить как качественный, так и количественный структурный анализ.
- Протоколы подготовки образцов и визуализации необходимы для успешного применения.
- Этот метод может улучшить понимание структур белков.
Цель исследования
- Предоставить всеобъемлющий руководство для подготовки сеток ЭМ и окрашивания образцов.
- Продемонстрировать визуализацию белков с использованием отрицательного окрашивания в ЭМ.
- Способствовать рутинному использованию этого метода в анализе белков.
Использованные методы
- Подготовка сеток для электронной микроскопии.
- Нанесение раствора отрицательного окрашивания на образцы белков.
- Визуализация образцов в электронном микроскопе.
- Запись изображений в оптимальных условиях.
Основные результаты
- Получены контрастные изображения белков.
- Успешно продемонстрированы подробные протоколы.
- Визуальные пособия улучшили понимание сложных этапов.
- Результаты подтверждают использование отрицательного окрашивания в ЭМ для рутинного анализа белков.
Выводы
- Отрицательное окрашивание в ЭМ является эффективным методом визуализации белков.
- Предоставленные протоколы могут легко выполняться начинающими пользователями.
- Эта техника может дополнять другие биохимические анализы.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Negative stain electron microscopy (EM) provides rapid, high-contrast visualization of purified proteins and macromolecular complexes, enabling early-stage assessment of sample quality and assembly state. This technique supports critical go/no-go decisions in discovery pipelines by confirming sample homogeneity and complex formation before resource-intensive downstream studies. Its accessibility and reproducibility make it a foundational tool for structural biology teams in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein complexes to confirm assembly and integrity.
- Supports rapid assessment of sample homogeneity, reducing ambiguity in target validation.
- Facilitates early detection of aggregation or degradation, de-risking downstream workflows.
- Provides visual evidence to support mechanistic hypotheses in target selection.
Screening & Assay Development
- Validates the quality of protein preparations prior to high-throughput screening or assay development.
- Ensures reproducibility and standardization of sample inputs for quantitative assays.
- Enables scalable preparation of validated EM grids for repeated use in screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein structure or assembly.
Translational & Preclinical Research
- Confirms structural integrity of therapeutic candidates prior to preclinical studies.
- Aligns visual data with biochemical and biophysical assays for translational continuity.
- Reduces risk of advancing structurally compromised candidates into preclinical models.
- Provides foundational data for subsequent 3D reconstruction and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Negative stain EM is positioned at the interface of protein purification and structural or functional characterization, bridging early discovery and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein complexes and assemblies.
- Screening: Confirms sample quality and reproducibility for downstream assays.
- Analytics: Provides high-contrast images for quantitative assessment of sample homogeneity and aggregation.
- Translational Research: Ensures structural fidelity of candidates entering preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, routine assay adaptable across diverse protein targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sample quality and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable visualization workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid preparation and instrument operation.
- Needs access to electron microscopy infrastructure and staining reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and complex types.
- Limited to surface visualization; not suitable for high-resolution internal structure analysis.
