Визуализация динамики кальция в волосковых клетках латеральной линии личинок данио-рерио

Возьмем парализованную трансгенную личинку данио-рерио, установленную в перфузионной камере.

Личинка экспрессирует мембранно-локализованные показатели кальция в волосковых клетках невромаста, компонента системы латеральной линии, которая обнаруживает движение воды.

Волосковые клетки состоят из апикальных пучков волос и базальных пресинаптических областей, которые образуют синапсы с афферентными нейронами для передачи сигналов.

Под конфокальным микроскопом используйте малое увеличение, чтобы расположить жидкостную пипетку рядом с личинкой.

Увеличьте увеличение, чтобы найти нейромачту, переместите пипетку рядом с ней и переключитесь на

флуоресцентную визуализацию.

Подавайте импульсы жидкости для отклонения пучков волос, открывая каналы механотрансдукции для апикального притока катионов, включая ионы кальция.

Слабофлуоресцентные индикаторы связываются с кальцием, вызывая локализованное повышение флуоресценции.

Приток катионов деполяризует клетку, вызывая поступление кальция через потенциал-зависимые каналы в базальном пресинапсе, где он связывается с индикаторами и локально увеличивает флуоресценцию.

Визуализируйте апикальную и базальную динамику кальция в режиме реального времени.

Во время этой процедуры заполните 10 микролитров нейронального буфера в правильно сломанную иглу для струи жидкости с помощью гелевой насадочной иглы. Равномерно загрузите раствор до кончика без пузырьков. Затем вставьте иглу в держатель пипетки, прикрепленный к моторизованному микроманипулятору.

Поместите перфузионную камеру в адаптер круглой камеры на предметном столике микроскопа. Перемещайте моторизованную ступень так, чтобы личинка оказалась в центре поля зрения. Впоследствии поверните адаптер круглой камеры так, чтобы ось A-P личинки была примерно выровнена с траекторией иглы струи жидкости.

Используя контраст проходящего света и дифференциальной интерференции, сфокусируйте личинку и центрируйте ее под объективом 10x. Затем поднимите цель 10x. С помощью моторизованного микроманипулятора опустите иглу струи жидкости вниз в центр поля зрения, чтобы она освещалась проходящим светом и едва касалась нейронального буфера.

Опустите объектив 10x, чтобы сфокусироваться на личинке и подтвердить ее местонахождение. Наведите объектив на иглу струи жидкости. Перемещайте иглу жидкостной струи с микроманипулятором по осям x и y до тех пор, пока она не окажется в положении, параллельном дорсальной стороне личинки.

После этого снова сосредоточьтесь на личинке. Опустите иглу вниз по оси z и расположите иглу вдоль спинной стороны рыбы, на расстоянии 1 миллиметра от тела. Осторожно переместите адаптер круглой камеры, чтобы убедиться, что игла струи жидкости выровнена по средней линии A-P личинки.

Затем переключитесь на цель 60x воды. Убедитесь, что объектив погружен в нейронный буфер. Используйте тонкий фокус для определения местоположения нейромасты. Затем переместите моторизованную сцену, чтобы разместить интересующую вас нейромачту в центре поля зрения.

Держите кончик иглы струей жидкости вдоль спинной стороны рыбы. Не прикасайтесь кончиком иглы струи жидкости к личинке или поверхности камеры. Расположите иглу струи жидкости с микроманипулятором так, чтобы она находилась на расстоянии 100 микрометров от внешнего края нейромасты.

Затем сосредоточьтесь на кончиках верхушечных пучков волос. Нижняя часть иглы струи жидкости должна быть в фокусе в этой плоскости. Установите высокоскоростной прижимной зажим из ручного режима во внешний режим, чтобы получать входные данные от программного обеспечения для обработки изображений. Обнулите высокоскоростной прижимной зажим, нажав кнопку «ноль», и с помощью ручки заданного значения установите слегка положительное давление в состоянии покоя. Подтвердите нахождение в состоянии покоя высокоскоростного прижимного зажима с помощью манометра PSI, прикрепленного к выходу напорного столика.

Чтобы определить давление, необходимое для стимуляции пучков волос, примените тестовый стимул с выходным напряжением 0,125 и 0,25 вольт в течение 200-500 миллисекунд. Для каждого тестового стимула измерьте расстояние отклонения кончиков пучков волос (киноцилия). Выберите давление, которое перемещает пучки на расстояние примерно 5 микрометров. Следите за тем, чтобы кончики киноцилий все время оставались в фокусе.

Чтобы получить изображения в одной плоскости, выберите стимул для доставки во время съемки в течение 80 кадров после кадра 30 в течение трех секунд. Чтобы измерить механочувствительные реакции кальция, сосредоточьтесь на основании апикальных пучков волос и начните получение изображения. Чтобы измерить пресинаптические реакции кальция, сосредоточьтесь на основании волосковых клеток и начните получение изображения.