Визуализация глубоких тканей мозга рыбки данио с помощью трехфотонного флуоресцентного микроскопа

Поместите чашку Петри, содержащую рыбку данио-рерио, находящуюся под наркозом, с трубкой, вставленной в ее рот, для подачи насыщенной кислородом воды, под объектив с малым увеличением трехфотонного микроскопа.

Мозг рыбки данио содержит генетически модифицированные нейроны, экспрессирующие флуоресцентно меченые белки для визуализации глубоких тканей во время визуализации.

Подсвечивайте блюдо с помощью светодиодного источника света, а параметры визуализации настраивайте для четкости изображения.

Опустите линзу объектива до тех пор, пока не станет видна рыбка данио, центрируя ее голову в поле зрения.

Замените объектив с малым увеличением на объектив с высоким разрешением для получения трехфотонных изображений.

Осторожно опустите объектив до тех пор, пока голова не станет видна без физического контакта, и установите значения оси на ноль.

Выключите светодиодный источник света и закройте темную шторку, чтобы свести к минимуму фоновый шум.

Установите параметры визуализации и выполните трехфотонную визуализацию, где более длинные волны обеспечивают трехфотонное возбуждение глубоких тканей.

При возбуждении нейронные флуорофоры излучают флуоресценцию, что позволяет визуализировать нейроны на различной глубине в режиме реального времени.

Для получения изображений поместите объектив с малым увеличением на трехфотонный микроскоп. Затем поместите чашку Петри с рыбой и трубками под микроскоп и используйте светодиодный источник света для освещения чашки Петри. В программном обеспечении для получения изображений откройте режим камеры. Нажмите «Опубликовать». Выберите канал А в правой части экрана и отрегулируйте параметры гистограммы, чтобы изображение было четко видно.

Установив настройку двигателя на контроллере двигателя в положение «база», опустите объектив до тех пор, пока рыба не станет видна. Поместите центр головы рыбы в центр поля зрения. Затем переместите цель вверх и подальше от головы рыбы. Замените объектив с малым увеличением на объектив с высокой числовой апертурой для получения изображений с тремя фотонами. Затем переместите его ближе к голове рыбы. Установите значения осей всех двигателей равными нулю.

Медленно опустите линзу объектива, следя за тем, чтобы объектив не соприкасался с головой физически. В программном обеспечении ПЗС-камеры остановите перемещение объектива, когда видна макушка головы. И установите местоположения x, y и z равными нулю. Выключите светодиодный источник света и закройте темную шторку вокруг системы. Затем установите программное обеспечение для получения изображений в режим многофотонной GG для трехфотонной визуализации и установите мощность под объективом на менее одного милливатта.

Нажмите кнопку «Трансляция» в программе для получения изображений. Откройте каналы ФЭУ и при необходимости отрегулируйте усиление ФЭУ и уровень фона. Медленно перемещайтесь вверх по линзе объектива, чтобы определить поверхность головы, наблюдая за каналом THG от крупных кровеносных сосудов и поверхности оконного стекла.