Спонтанная визуализация кальция для компартмент-специфичной динамики в астроцитах

Возьмите покровное стекло с полимерным покрытием, содержащее смешанную культуру нейронов и астроцитов в записывающей камере.

Эти трансфицированные клетки экспрессируют кальций-чувствительные белки на плазматических и ER-мембранах, флуоресцируя при связывании с кальцием для отслеживания субклеточной динамики кальция.

Добавьте среду, содержащую ионы кальция, и накройте камеру, чтобы предотвратить испарение.

Поместите камеру под флуоресцентный микроскоп.

Ионы кальция связываются с кальций-чувствительными белками. При облучении синим светом чувствительные к кальцию белки на внешней мембране ER флуоресцируют зеленым цветом. Используйте эту зеленую флуоресценцию для определения местоположения астроцитов.

Далее облучайте зеленым светом. Чувствительные к кальцию белки на плазматической мембране флуоресцируют красным цветом. Подтвердите наличие красной флуоресценции у того же астроцита, проявляющего зеленую флуоресценцию.

Запишите покадровые изображения кальций-чувствительных белков на плазматической мембране, а затем кальций-чувствительных белков на внешней мембране ER.

Проанализируйте изображения, чтобы наблюдать специфическую для компартмента спонтанную активность кальция в выбранном астроците.

Установите покровное стекло с клетками, трансфицированными Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f, в записывающую камеру микроскопа. Добавьте 400 микролитров носителя изображения и накройте камеру крышкой. Выберите набор фильтров для GCaMP6f и источник света. Найдите астроциты, экспрессирующие OER-GCaMP6f.

Далее выберите набор фильтров и источник света для RCaMP2. И подтвердить, экспрессируется ли Lck-RCaMP2 в тех же астроцитах. Записывайте покадровые изображения Lck-RCaMP2 с частотой 2 герц в течение двух минут и сохраняйте данные изображения.

После этого измените установленный фильтр обратно на фильтр для GCaMP6f. Запись цейтраферных изображений OER-GCaMP6f с частотой 2 Гц в течение двух минут. Затем сохраните данные изображения.