Эффективное Вывод прав Сердечная Прекурсоры и кардиомиоциты из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении сердечных потомков непосредственно и исключительно из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с использованием индукции малыми молекулами. Это достигается путем добавления никотинамида к недифференцированным ЭСК человека, поддерживаемым в определенных условиях. Затем клетки, дифференцирующиеся в сердечные, отделяют для формирования кардиобластов — плавающих клеточных кластеров в суспензионной культуре.

После формирования кардиобласты помещают в среду для кардиальной дифференцировки, где они продолжают развиваться в сокращающиеся кардиомиоциты. В конечном итоге результаты оценивают с помощью иммунофлуоресценции с применением деконволюционной или конфокальной микроскопии, а также путем электрофизиологических записей. Основным преимуществом данного метода является то, что он позволяет эффективно индуцировать плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки человека исключительно в сторону кардиальной линии путем простого добавления малых молекул.

В то время как при использовании существующих методов мультилинейной дифференцировки лишь небольшая часть клеток приобретает кардиальный фенотип. При приготовлении стоковых растворов следует обратить внимание на несколько важных этапов. Медленно размораживайте matrigel и ламинин человека, перенося их из температуры −80 °C в среду с температурой 4 °C в течение ночи; храните среды при 4 °C и всегда подогревайте среды до 37 °C перед использованием.

Кроме того, при приготовлении среды для человеческих ЭСК некоторые добавки вводятся непосредственно перед использованием. К ним относятся BFGF, аскорбиновая кислота, активный человеческий инсулин и трансферрин. Затем приготовьте рабочие растворы матригеля или человеческого ламинина непосредственно перед нанесением покрытия на планшет.

После подготовки культуральных планшетов, предварительно покрытых желатином, инкубируйте их при 37 °C в 5% carbon dioxide. Желатин можно заменить рабочим раствором Matrigel или ламинина. Покрывайте планшеты путем инкубации в течение ночи при 4 °C.

Начните с того, что дайте колониям эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека расти в течение пяти-семи дней, после чего подготовьтесь к пассированию некоторых из них. Выбирайте колонии, содержащие более 75% недифференцированных ЭСК человека. Обычно они слегка опалесцируют, имеют четкие границы и состоят из наслоенных клеток. Признаком начала дифференцировки обычно являются белые колонии; колонии, состоящие преимущественно из дифференцированных клеток, обычно выглядят прозрачными.

Не выбирайте белые или прозрачные колонии. Поднесите чашки к источнику света и с помощью маркера обведите слегка опалесцирующие колонии на дне чашек по их контуру. Используйте край стерильного наконечника дозатора P2, чтобы отделить окружающий слой фибробластов от колонии эмбриональных стволовых клеток человека.

Затем удалите окружающие фибробласты, а также все дифференцированные части колонии. Теперь аспирируйте старую среду, содержащую отслоившиеся дифференцированные клетки. Далее в каждой лунке один раз промойте недифференцированные клетки средой для человеческих ЭСК без bFGF, а затем добавьте три миллилитра свежей среды для человеческих ЭСК, содержащей bFGF; bFGF добавляется в свежую среду непосредственно перед использованием.

Теперь с помощью стерильного наконечника дозатора P2 разделите колонии на мелкие фрагменты и отделите их от поверхности планшета. Перенесите отделенные фрагменты колоний вместе с питательной средой в коническую пробирку объемом 50 мл. Дополнительно промойте каждую лунку 1 мл среды, перенеся полученный раствор в пробирку.

Теперь клетки готовы к дальнейшей дифференцировке с использованием малых молекул. Сначала прогрейте свежепокрытые планшеты до 37 °C. Отсосите раствор для покрытия из лунок и добавьте в каждую лунку по 4 мл среды, содержащей фрагменты колоний, затем осторожно перенесите планшеты в инкубатор, избегая встряхивания.

Не беспокойте планшеты, чтобы обеспечить прикрепление клеток. Затем удалите большую часть старой среды, оставив ровно столько, чтобы клетки оставались погруженными в жидкость. Не допускайте высыхания клеток.

Смешайте свежую среду ESL для человека, содержащую basic FGF и никотинамид, и добавьте по несколько миллилитров этой среды в каждую лунку. Среду можно хранить до двух недель при температуре 4 °C, используя её для обновления клеточной культуры каждые два дня для роста колоний. Через 8–10 дней морфология клеток изменится: они превратятся в крупные дифференцированные клетки, которые размножатся и образуют многослойные скопления.

Затем переходите к созданию суспензионной культуры. Чтобы начать культивирование в суспензии, отделите колонии ESL от клеток, которые спонтанно дифференцировались и мигрировали, образовав слой фибробластов. Используйте вышеописанный метод с помощью стерильного наконечника пипетки, затем аспирируйте старую среду, содержащую плавающие отделенные клетки фибробластов. Один раз промойте клетки средой для HESC и повторно суспендируйте их в трех миллилитрах среды для HESC, используя на этот раз стерильный наконечник пипетки P2.

Разрежьте колонии на мелкие фрагменты и отделите их от планшета. Перенесите среду с отделенными колониями в одну коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте лунки одним миллилитром среды и добавьте раствор для промывки к общему объему.

Затем распределите по четыре миллилитра объединенной суспензии клеток в каждую лунку шестилуночного планшета с ультранизкой адгезией на четыре-пять дней. Поместите планшет в инкубатор, чтобы обеспечить формирование плавающих клеточных кластеров или кардиобластов, способствуя их переходу в фенотип сокращающихся кардиомиоцитов. Соберите их вместе с питательной средой в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Затем центрифугируйте клетки при 1 400 об/мин в течение пяти минут. Аспирируйте, максимально точно измерьте объем удаленной старой среды и добавьте равный объем свежей среды для кардиальной дифференцировки, содержащей 10 мM никотинамида.

Перемешайте всплывшие кардиобласты с помощью пипетирования, затем распределите по 4 мл суспензии кардиобластов в каждую лунку 6-луночного планшета для культивирования тканей. Перенесите планшеты в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C, чтобы кардиобласты прикрепились к поверхности планшетов в течение ночи. Повторяйте процедуру каждые два дня культивирования.

На восьмой день замените среду для кардиальной дифференцировки, содержащую 10 мМ никотинамида. Перейдите на среду для кардиальной дифференцировки без никотинамида; продолжайте заменять среду через день.

В течение двух недель после отмены никотинамида начнут появляться сокращающиеся кардиомиоциты, число которых будет расти; никотинамида достаточно для того, чтобы индуцировать переход эмбриональных стволовых (ЭС) клеток человека, поддерживаемых в определенной системе культивирования, из состояния плюрипотентности исключительно в кардиомезодермальный фенотип. При воздействии никотинамида на недифференцированные ЭС клетки человека все клетки в колонии подвергались морфологическим изменениям, превращаясь в крупные дифференцированные клетки с пониженной экспрессией OCT4. В этих клетках также началась экспрессия специфического для сердца фактора транскрипции NKX2.5, а также экспрессия альфа-актинина.

Обе характеристики соответствуют фенотипу кардиомезодермы. Эти дифференцированные клетки продолжают делиться и увеличиваться в размере в тех областях колоний, где клетки располагались плотными слоями. Экспрессия NKX 2.5 стала более интенсивной. После открепления эмбриональные стволовые клетки человека, обработанные никотинамидом, образовали кардиобласты в суспензионной культуре.

После того как кардиобластам дали прикрепиться, их обрабатывали никотинамидом в течение одной недели; через одну-две недели после прекращения воздействия никотинамида начали появляться сокращающиеся кардиомиоциты с резким увеличением эффективности. Они выглядели как клеточные кластеры с ритмичными сокращениями; при спонтанной мультилинейной дифференцировке клеток, не подвергавшихся обработке IDE, такие характеристики не проявлялись. Клетки в составе кластеров сокращающихся кардиомиоцитов экспрессировали маркеры, характерные для кардиомиоцитов, включая NK X 2.5 и альфа-актинин.

С помощью электрических профилей было подтверждено, что сокращения бьющихся кардиомиоцитов являются сильными, ритмичными, скоординированными и синхронизированными; они демонстрировали регулярные импульсы, напоминающие комплексы P-Q-R-S-T, которые регистрируются электродами на поверхности тела при клиническом снятии электрокардиограмм. Кроме того, кардиомиоциты могли сохранять свою высокую сократительную способность более трех месяцев. При правильном выполнении эта освоенная методика может быть использована для равномерного получения предшественников сердечных клеток и бьющихся кардиомиоцитов из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека примерно за пять недель.