Неоднородность Картирование экспрессии белка в опухолях с использованием количественных иммунофлуоресценции

Общая цель данного эксперимента заключается в точной количественной оценке экспрессии биомаркеров на целых участках тканей рака человека с целью присвоения числового значения степени гетерогенности экспрессии белка. Это достигается путем сканирования иммунофлуоресцентно меченных участков раковой ткани с помощью цельного стекового флуоресцентного сканера. Затем для оценки выбираются области, представляющие интерес внутри опухоли.

Затем экспрессия белка, представляющего интерес, в инвазивных опухолевых областях количественно оценивается с помощью автоматизированной системы анализа изображений aqua analysis. В конечном счете, этот метод может быть использован для картирования экспрессии биомаркеров в раковой ткани, которая часто очень неоднородна по всему тканевому срезу. Основное преимущество использования этих методов по сравнению с традиционными методами, такими как иммуногистохимия с использованием реагентов для цветной и метрической визуализации, заключается в том, что иммунофлуоресценция является более количественной и более чувствительной.

Объединяя эти аналитические методы с целым срезом, иммунофлуоресцентное сканирование позволяет мелкозернистое картирование тонких вариаций экспрессии биомаркеров в тканях. Впервые эти процедуры демонстрирует Марк Густафсон, непосредственный директор по операциям в лаборатории Histo RX. После микротома, среза биопсии раковой ткани и иммунофлуоресцентного окрашивания препарата для экспрессии биомаркеров, представляющих интерес, загрузите до пяти слайдов окрашенных срезов в кассету предметного стекла сканера слайдов.

Затем с помощью интерфейса в консоли сканирующего прицела. Для каждого предметного стекла выберите область, охватывающую всю ткань на предметном стекле, независимо от характера окрашивания или других наблюдаемых аспектов образца. Затем, используя консоль сканирующего эндоскопа, сначала выберите область ткани для идеальной оценки в пределах опухолевой области ткани, чтобы обеспечить наилучшее представление.

Теперь с помощью функции автоматической экспозиции консоли скан-эндоскопа определите время экспозиции для каждого канала вместе с фокусом изображения, используйте синий ромб на изображении консоли скан-эндоскопа, чтобы выбрать дополнительную область вдали от ткани, но все еще в пределах области предметного стекла под покровным листом, чтобы определить область фона, где будут получены изображения коррекции плоского поля. Для каждого фильтра добавьте точки фокусировки на область ткани, представленную желтыми квадратами, чтобы оптимизировать захват изображения. Если изображения имеют высокий фон или другие артефакты изображения, область изображения следует переместить и получить новые изображения.

Затем ткань сканируется, а полученные цифровые изображения слайдов автоматически загружаются в базу данных спектра Aperio. Дважды щелкните миниатюру изображения для программы использования спектра, чтобы выбрать слайд для анализа из списка цифровых слайдов в базе данных спектра. Затем с помощью прилагаемого аннотированного изображения h и d аннотируйте интересующую область на флуоресцентном изображении.

На одном образце можно выбрать несколько областей интереса, очерченных отдельными кругами. Аннотированные изображения автоматически сохраняются в базе данных спектра. Теперь выберите «Анализ» в строке меню в верхней части экрана, когда появится окно анализа, выберите анализ аква histo RX в раскрывающемся меню.

Когда все будет готово начать, нажмите кнопку анализа, на панели задач Windows появится свернутое консольное окно, отображающее ход передачи изображений из базы данных Spectrum на локальный компьютер. После того, как данные будут переданы, будет запущен акваанализ для создания акваоценки с использованием неконтролируемого алгоритма акваоценки, основанного на кластеризации данных первого порогового значения образца, сигнала изображения панцитокератина над сигналом фонового изображения. Это позволит использовать пиксели для определения маски опухоли, которую затем можно будет использовать для последующих расчетов.

Используйте высокоэкспрессивные пиксели панцитокератина для определения цитоплазматических или безъядерных областей опухолевых клеток. Как видно на рисунке, пиксели с высоким сигналом в канале DPI, находящиеся внутри маски опухоли, идентифицируются как ядерные по своей природе. Если после проверки будут выявлены поля, которые не подходили для оценки из-за артефактов образца или изображения, эти поля будут удалены из оценки и также выдадут окончательный результат неудачи.

Результаты акваскоринга представлены в виде таблицы оценок, связанных с каждой плиткой размером 512 на 512 пикселей в интересующей области в пределах всего среза ткани, которая может быть сохранена и использована для последующего статистического анализа. Эти микрофотографии с окрашиванием гемат тоин и эоин демонстрируют, как различные области одного и того же рака яичников могут проявлять изменчивую морфологию. На снимке высокой мощности в правом верхнем углу рисунка B выделены клетки с цитоплазматическим очищением и устойчивым характером роста в верхней части опухоли.

Однако нижняя часть ткани, увеличенная в нижней правой части рисунка С, имеет более однородную эозинофильную цитоплазму и папиллярный характер роста. Здесь тепловые карты гетерогенности экспрессии ER в тканевом срезе рака яичников до и после химиотерапии показаны на верхней и нижней панелях соответственно. Обратите внимание на изменение от переменной экспрессии ER по разделу с областями как высокой, так и низкой экспрессии на верхнем рисунке к равномерному распределению высокой экспрессии ER, показанному красным цветом на нижнем рисунке.

Числовое представление этого изменения обозначено слева уменьшением индекса Симпсонов. На этом рисунке снова показаны тепловые карты гетерогенности двух HER в тканевом срезе рака яичников до и после терапии, как видно на верхней и нижней панелях соответственно. Обратите внимание еще раз на изменение экспрессии переменной HER two по сечению с областями как высокой, так и низкой экспрессии на верхнем рисунке к равномерному распределению высокой экспрессии HER two на нижнем рисунке.

И снова наблюдается снижение индекса Симпсонов. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что качество данных, полученных в результате вычислительного анализа, настолько хорошее, насколько хорошо качество окрашивания, и оно должно соответствовать высокому техническому стандарту.