Неоднородность Картирование экспрессии белка в опухолях с использованием количественных иммунофлуоресценции
25 октября 2011 г.
Здесь мы опишем метод количественного молекулярной неоднородности в гистологических срезов опухолевого материала с использованием количественных иммунофлюоресценции, анализ изображений, а статистическая мера неоднородности. Метод предназначен для использования в клинической разработке биомаркеров и анализа.
Общая цель следующего эксперимента заключается в точном количественном определении экспрессии биомаркеров в целых срезах тканей рака человека для присвоения числового значения степени гетерогенности экспрессии белков. Это достигается путем предварительного сканирования иммунофлуоресцентно меченных срезов раковой ткани с помощью флуоресцентного сканера для целых слайдов. Затем для последующей оценки выбираются области интереса внутри опухоли.
Затем экспрессия исследуемого белка в областях инвазивной опухоли количественно оценивается с помощью автоматизированной системы анализа изображений aqua analysis. В конечном итоге данный метод может быть использован для картирования экспрессии биомаркеров в раковой ткани, которая зачастую характеризуется высокой гетерогенностью на протяжении всего среза ткани. Основным преимуществом использования этих методов по сравнению с традиционными подходами, такими как иммуногистохимия с применением цветовых и метрических визуализирующих реагентов, является то, что иммунофлуоресценция более количественна и обладает более высокой чувствительностью.
Сочетание этих аналитических методов со сканированием целого среза методом иммунофлуоресценции позволяет проводить детальное картирование незначительных вариаций экспрессии биомаркеров в различных тканях. Впервые эти процедуры демонстрирует Марк Густафсон, операционный директор лаборатории Histo RX. После микротомирования среза биопсии раковой ткани и иммунофлуоресцентного окрашивания образца на экспрессию интересующих биомаркеров поместите до пяти предметных стекол с окрашенными срезами в кассету сканера слайдов.
Затем, используя интерфейс консоли сканера ScanScope, для каждого предметного стекла выберите область, охватывающую всю ткань на стекле, независимо от характера окрашивания или других наблюдаемых аспектов образца. Далее, с помощью консоли ScanScope, выберите область ткани для анализа, желательно в пределах опухолевого участка ткани, чтобы обеспечить наилучшую репрезентативность.
Теперь, используя функцию автоматической экспозиции консоли сканирующего микроскопа, определите время экспозиции для каждого канала, а также фокус изображения; используйте синий ромб на изображении консоли сканирующего микроскопа, чтобы выбрать дополнительную область вдали от ткани, но все еще в пределах области предметного стекла под покровным стеклом, для определения фоновой области, в которой будут получены изображения для коррекции плоского поля. Для каждого фильтра добавьте точки фокусировки на область ткани, обозначенные желтыми квадратами, чтобы оптимизировать захват изображения. Если изображения имеют высокий уровень фона или другие артефакты, область изображения следует переместить и произвести повторный захват.
Затем ткань сканируют, и полученные цифровые изображения срезов автоматически загружаются в базу данных Aperio Spectrum. Дважды щелкните по миниатюре изображения в программе Spectrum, чтобы выбрать нужный срез для анализа из списка цифровых срезов в базе данных Spectrum. Затем, используя сопровождающее аннотированное изображение гематоксилином и эозином (H&E), отметьте область интереса на флуоресцентном изображении.
На одном образце можно выделить несколько областей интереса, обозначив каждую отдельным кругом. Аннотированные изображения автоматически сохраняются в базе данных спектров. Теперь выберите «Analyze» (Анализ) на панели меню в верхней части экрана; когда появится окно анализа, выберите «histo RX aqua analysis» из выпадающего списка.
Когда будете готовы начать, нажмите кнопку анализа. В панели задач Windows появится свернутое окно консоли, в котором будет отображаться ход переноса изображений из базы данных Spectrum на локальный компьютер. После завершения передачи данных запустится программа aqua analysis для расчета показателя aqua score с использованием алгоритма ненаблюдаемого скоринга aqua, основанного на кластеризации данных по первичному пороговому значению — сигналу изображения пан-цитокератина выше уровня фонового сигнала изображения. Это позволит использовать пиксели для определения маски опухоли, которая затем будет применяться для последующих расчетов.
Используйте пиксели с высоким уровнем экспрессии пан-цитокератина также для определения цитоплазматических или ненуклеарных областей опухолевых клеток. Как показано здесь, пиксели с сильным сигналом в канале DPI, находящиеся внутри маски опухоли, идентифицируются как ядерные. Если при проверке будут выявлены поля, непригодные для оценки из-за артефактов образца или визуализации, такие поля исключаются из анализа, что также приведет к конечному результату «неудовлетворительно» (fail).
Результаты оценки aqua представлены в виде таблицы баллов, соответствующих каждому фрагменту размером 512 на 512 пикселей в области интереса образца целого среза ткани, которую можно сохранить и использовать для последующего статистического анализа. Эти микрофотографии, окрашенные гематоксилином и эозином, демонстрируют, как разные области одной и той же опухоли при раке яичников могут иметь вариабельную морфологию. Вид при большом увеличении в верхнем правом углу Рисунка B подчеркивает наличие клеток с просветлением цитоплазмы и солидный тип роста в верхней части опухоли.
Однако нижняя часть ткани, увеличенная в правом нижнем секторе на Рисунке C, характеризуется более гомогенной эозинофильной цитоплазмой и папиллярным типом роста. Здесь на верхней и нижней панелях соответственно представлены тепловые карты гетерогенности экспрессии ER в срезе ткани рака яичника до и после химиотерапии. Обратите внимание на переход от вариабельной экспрессии ER по всему срезу с областями как высокой, так и низкой экспрессии на верхнем рисунке к равномерному распределению высокой экспрессии ER, обозначенному красным цветом на нижнем рисунке.
Численное представление этого изменения indicated слева уменьшением индекса Симпсона. На данном рисунке снова представлены тепловые карты гетерогенности HER2 в срезе ткани рака яичника до и после терапии, показанные на верхней и нижней панелях соответственно. Обратите внимание на изменение от вариабельной экспрессии HER2 по всему срезу с областями как высокой, так и низкой экспрессии на верхнем рисунке к равномерному распределению высокой экспрессии HER2 на нижнем рисунке.
В очередной раз наблюдается снижение индекса Симпсона. При выполнении данной процедуры важно помнить, что качество данных, полученных в результате вычислительного анализа, напрямую зависит от качества окрашивания, которое должно быть выполнено на высоком техническом уровне.
Обзор
В данной статье представлен метод количественной оценки молекулярной гетерогенности в гистологических срезах опухоли с использованием количественной иммунофлуоресценции и анализа изображений. Данный подход направлен на совершенствование разработки клинических биомаркеров путем предоставления статистической меры гетерогенности экспрессии белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Иммунология
Теоретические основы
- Количественное определение экспрессии биомаркеров имеет решающее значение в исследованиях рака.
- Традиционные методы, такие как иммуногистохимия, имеют ограничения по чувствительности и количественной оценке.
- Иммунофлуоресценция предлагает более количественный подход к оценке экспрессии белков.
- Понимание гетерогенности опухолей может помочь в определении стратегий лечения.
Цель исследования
- Для точной количественной оценки экспрессии биомаркеров на срезах тканей целиком.
- Для присвоения числовых значений степени гетерогенности экспрессии белков.
- Для улучшения картирования экспрессии биомаркеров в гетерогенных раковых тканях.
Используемые методы
- Сканирование срезов тканей с иммунофлуоресцентным окрашиванием с использованием сканера предметных стекол.
- Выбор областей интереса внутри опухоли для оценки.
- Количественное определение экспрессии белков с помощью автоматизированной системы анализа изображений aqua analysis.
- Создание тепловых карт гетерогенности для визуализации изменений экспрессии биомаркеров.
Основные результаты
- Продемонстрирована возможность картирования вариаций экспрессии биомаркеров в раковых тканях.
- Показаны изменения паттернов экспрессии до и после проведения химиотерапии.
- Приведена количественная оценка гетерогенности с использованием индекса Симпсона.
- Освещены преимущества иммунофлуоресценции по сравнению с традиционными методами.
Выводы
- Данный метод углубляет понимание гетерогенности биомаркеров в опухолях.
- Он предлагает более чувствительный и количественный подход для применения в клинической практике.
- Эта методика может помочь в разработке таргетной терапии на основе экспрессии биомаркеров.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественная оценка пространственной гетерогенности экспрессии белков в опухолях устраняет критический пробел в разработке препаратов на основе биомаркеров, поскольку традиционные методы анализа всего образца (bulk) или полуколичественные методы маскируют вариабельность на уровне субпопуляций, которая может влиять на терапевтический ответ и развитие резистентности. Обеспечивая численный, пространственно разрешенный показатель распределения биомаркера, данный метод позволяет проводить более точную стратификацию пациентов и способствует снижению механистических рисков при валидации мишеней и разработке аналитических систем. Применение этого метода для анализа ER и HER2 при раке яичников демонстрирует его непосредственную значимость для прогнозирования ответа на эндокринную и таргетную терапию, что позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении доклинических и ранних клинических программ.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования гетерогенности экспрессии биомаркеров как независимой переменной в исследованиях по валидации мишеней.
- Операционная ценность: способствует функциональной валидации мишеней, позволяя определить, отражают ли наблюдаемые уровни биомаркеров равномерное взаимодействие с мишенью или же они искажены внутриопухолевой вариабельностью.
- Прогностическая ценность: оптимизирует отбор проектов в портфеле путем идентификации мишеней с однородными паттернами экспрессии, которые с большей вероятностью обеспечат стабильный ответ на препарат в различных областях опухоли.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Создает валидированные карты экспрессии белков с пространственным разрешением, которые служат количественными эталонами для разработки и стандартизации методов анализа на основе иммунофлуоресценции.
- Воспроизводимость: Использует автоматизированное создание плиток (tiling) и систему оценки AQUA для минимизации субъективности наблюдателя и обеспечения согласованного количественного анализа различных срезов тканей и экспериментальных партий.
- Масштабируемость скрининга: Генерирует данные на уровне плиток, совместимые с рабочими процессами высококонтентного анализа, что позволяет масштабируемо оценивать влияние соединений на распределение биомаркеров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Связывает измерения гетерогенности на этапе открытия с доклинической валидацией, предоставляя релевантную системе заболевания модель для оценки стабильности биомаркеров до и после терапевтического вмешательства.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет количественно оценить изменения гетерогенности экспрессии ER и HER2 до и после химиотерапии, предлагая прогностический биомаркер фенотипических сдвигов, вызванных терапией.
- Продвижение с учетом скорректированных рисков: Поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), определяя, являются ли терапевтические эффекты однородными или селективными, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях из-за непредвиденного появления резистентных субклонов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум разработки — от валидации мишени до идентификации ведущего соединения и доклинической оценки, что особенно важно для терапии на основе биомаркеров, где паттерны пространственной экспрессии влияют на эффективность препаратов и механизмы резистентности.
- Биологические исследования: Оказывает поддержку в проверке гипотез, позволяя количественно оценить гетерогенность экспрессии белков как переменную в механистических исследованиях биологии опухолей и сигнальных путей.
- Скрининг: Обеспечивает получение готовых к анализу количественных данных (показатели AQUA на один фрагмент), что способствует воспроизводимому скринингу соединений в моделях гетерогенных опухолей.
- Аналитика: Позволяет создавать тепловые карты гетерогенности и вычислять показатели на основе индекса Симпсона, предоставляя статистические метрики для сравнения условий и отслеживания изменений экспрессии с течением времени или в ходе лечения.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность доклинических исследований, демонстрируя изменения экспрессии биомаркеров после лечения, что позволяет разрабатывать стратегии фармакодинамического мониторинга.
- Корпоративное использование: Создает универсальную платформу для визуализации и анализа, применимую для различных типов рака и биомаркеров, что сокращает необходимость в повторной разработке методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования значимости биомаркеров за счет снижения механистической неопределенности, вызванной неучтенной внутриопухолевой гетерогенностью.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированную и воспроизводимую количественную оценку благодаря автоматизированному анализу изображений и валидированным протоколам окрашивания.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя раньше выявлять биомаркеры с равномерной экспрессией, что сокращает инвестиции в мишени, которые с большой вероятностью окажутся несостоятельными из-за гетерогенности их доступности.
- Влияние на портфель: Обосновывает приоритизацию с учетом рисков, выделяя биомаркеры, при которых гетерогенность коррелирует с плохим прогнозом или вариабельным ответом на лечение.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области иммунофлуоресцентного окрашивания, сканирования целых препаратов и анализа изображений с помощью алгоритма AQUA.
- Метод зависит от высокого качества мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания и наличия сканера целых препаратов с функцией спектрального разделения сигналов.
- Необходимы стандартизированные протоколы выбора областей интереса и коррекции фона для обеспечения сопоставимости результатов между различными лабораториями.
- Адаптация метода к альтернативным модельным системам (например, к ксенографтам или органоидам) требует валидации параметров маскирования эпителия и сегментации сигнала.
- Практические ограничения включают зависимость от специфичности антител и соотношения сигнал/шум, что может повлиять на точность количественного определения мишеней с низкой экспрессией.
