Параллельные пластины палаты потока и непрерывной цепи потока для оценки эндотелиальных клеток-предшественников при ламинарном Стресс сдвиговом потоке

Общая цель этой видеостатьи — описать метод воздействия на адгезивные клетки в условия ламинарного потока и оценить реакцию на хорошо поддающиеся количественной оценке напряжения сдвига жидкости. Это достигается путем предварительной сборки проточного контура без проточной камеры. Контур включает в себя резервуар импульсный, демпфер, жесткую трубку, мягкую трубку, четырехходовые стопорные краны и подключенные адаптеры для приманки, а также воздушный фильтр.

Следующим шагом является заполнение контура желаемой обильной восьмеркой, например, клеточной средой в стерильных условиях, а затем запуск насоса для заполнения демпфера импульсов и продувки трубок от воздуха. Затем следует вставка посадочного стекла ячейки в нижнюю пластину проточной камеры. Заключительным этапом процедуры является полная сборка проточного контура с выровненной проточной камерой

В конечном итоге могут быть получены результаты, показывающие выравнивание флуоресцентно меченых эндотелиальных клеток-предшественников под воздействием напряжения сдвига жидкости через прозрачную камеру с использованием флуоресцентного микроскопа для изучения функционального поведения клеток. Часто необходимо имитировать физиологию in vivo, подвергая клетки напряжению сдвига жидкости. Мы спроектировали параллельную проточную камеру с пластинами и контур непрерывного потока, которые позволяют нам изучать ячейки в условиях потока и наблюдать за ними через прозрачную камеру.

Этот метод может служить ценным исследовательским инструментом в области медицины и инженерии. Наша проточная камера позволяет визуализировать клетки под потоком в прерывистом режиме или в режиме реального времени с помощью вертикального или инвертированного микроскопа. Кроме того, конструкция доктора Ника позволяет исследователям визуализировать клетки на прозрачных или рентгеноконтрастных поверхностях с помощью стандартных линз микроскопа.

Кроме того, он может стать важным инструментом в фармакологических исследованиях для изучения влияния лекарств на клетки в условиях потока. Визуализация настройки имеет решающее значение, потому что некоторые шаги трудно освоить, читая только протокол. Я дам пошаговую инструкцию о том, как настроить проточную камеру и проточный контур, обычно используемые в лаборатории доктора Ока Некст: Чтобы собрать проточный контур.

Начните с прикрепления 36-дюймового сегмента жесткой трубки к одному концу демпфера импульсов на другом конце. Прикрепите 18-дюймовый сегмент мягкой трубки. Поместите адаптер для приманки с наружной резьбой на одну восьмую дюйма в конце 18-дюймовой мягкой трубки.

Подключите мужскую приманку к адаптеру для внутренней приманки размером в одну восьмую дюйма. Прикрепите женскую приманку к новому 18-дюймовому сегменту мягкой трубки. Просверлите три отверстия в стеклянной крышке стакана объемом 250 миллилитров.

Чтобы установить трубку, вставьте 1,5-дюймовый сегмент мягкой трубки в одно отверстие. В качестве вентиляционного отверстия. Вставьте свободные концы жесткой и мягкой трубки через два других отверстия в крышке в стеклянную бутылку объемом 250 миллилитров, которая будет действовать как резервуар.

Убедитесь, что жесткая трубка достигает дна резервуара. Поддержание стерильности на протяжении всего процесса установки контура имеет решающее значение для успеха этой процедуры. Поэтому все детали должны быть стерилизованы, и вы должны носить стерильные перчатки на всем протяжении.

Помимо собранных деталей, эти детали должны быть стерилизованы. Одна полная проточная камера, три на два дюймовых сегмента мягкой трубки, одна наружная и одна самка, один восьмой дюймовый адаптер для приманки, четыре полудюймовых винта с плоской головкой, 6 5 16 дюймов, восемь 30 секунд. Дюймовые дорожки на дюйм, винты с плоской головкой, одна пара пинцетов, одно стеклянное стекло и два полотенца, стерилизованные паром.

Автоклавирование при температуре 121 градус Цельсия в течение 60 минут. Поместите проточную камеру проточного контура четыре на четыре хода, запорные краны один за другим, запорный кран и все стерилизованные детали на это стерильное поле. Надев стерильные перчатки, соедините два четырехпозиционных стопорных крана.

Установите колпачки на открытые отверстия для образцов. Отсоедините адаптеры приманок с наружной и внутренней резьбой, прикрепленные к двум сегментам мягкой трубки проточного контура, и вставьте подключенные запорные краны. Вставьте вставленную в резервуар мягкую трубку в шприц объемом 30 миллилитров и извлеките поршень шприца.

Наполните бутылку 125 миллилитрами среды EPC. Подсоедините мягкую трубку к стопорному крану. Поместите стерильный шприцевой фильтр в вентиляционное отверстие.

Теперь перенесите проточный контур в увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа. Зажмите жесткую трубку в головке роликового насоса master flex, предназначенной для использования с этим типом угольных трубок Palmer. Следите за тем, чтобы трубки не перекрывались с монтажными дорожками роликового насоса.

Отметьте трубки в местах выхода из головки насоса с обеих сторон маркером. Убедившись, что все запорные краны закрыты в направлении отверстий для отбора проб и открыты по проточному контуру, запустите насос. Проверьте направление потока.

Восьмерка PERFUSE должна перемещаться из стеклянного резервуара через жесткую трубку в демпфер импульсов. Для сборки проточной камеры используйте стерильные перчатки, чтобы подсоединить один двухдюймовый сегмент мягкой трубки к адаптеру для приманки длиной одна восьмая дюйма. Подсоедините еще один двухдюймовый сегмент мягкой трубки к адаптеру для наружной приманки размером одна восьмая дюйма.

Прикрепите двухдюймовую мягкую трубку с адаптером для внутренней приманки к входному отверстию, а двухдюймовую мягкую трубку с адаптером для приманки с наружной резьбой к выходному оттоку. Прикрепите четырехсторонние стопорные краны к обоим этим адаптерам приманок. Подсоедините оставшуюся двухдюймовую мягкую трубку к боковому разъему порта, выходящему из пузырьковой ловушки, и прикрепите односторонний стопорный кран с помощью стерильного пинцета.

Извлеките предметное стекло из емкости для клеточной культуры и поместите его в углубление на нижней пластине проточной камеры. Убедитесь, что предметное стекло расположено сидячей стороной вверх с помощью шприца или пипетки, поместите 10 миллилитров теплой среды EPC на предметное стекло, сидящее на ячейке. Дайте фильтрующему материалу покрыть предметное стекло в проточной камере, но не проливайте его на уплотнительное кольцо на нижней пластине.

Поместите верхнюю пластину проточной камеры на нижнюю пластину, совместив отверстия для винтов. Держите две пластины параллельно, чтобы не занести пузырьки воздуха в винтовые пластины камеры. Вместе. С помощью автоматической аккумуляторной отвертки откройте входной пузырьковый клапан, открыв односторонний стопорный кран, прикрепленный к входному боковому отверстию пузырькового ловушки.

С помощью шприца объемом 10 миллилитров аккуратно промойте входную трубку средой EPC, а затем закройте этот стопорный кран и закройте его. Теперь обеспарните канал камеры, открыв выпускное отверстие четырехходовым запорным краном и аккуратно промыв среду EPC через проточную камеру. Снова с помощью 10-миллилитрового колпачка шприца зафиксируйте все четырехсторонние соединения крана и закройте их.

Перенесите проточную камеру в увлажненный инкубатор с собранным контуром потока. Приостановите насос проточного контура, чтобы перекрыть проточный контур. Запорите краны по направлению потока, чтобы предотвратить утечку.

Подключите проточную камеру к проточному контуру После того, как проточная камера была подключена к проточному контуру, откройте запорные краны по направлению потока. Возобновите работу насоса и убедитесь, что PERFUSE eight течет в правильном направлении. Отрегулируйте расход в соответствии с желаемым абсолютным напряжением.

Во время проточного эксперимента проточная камера может быть удалена из контура для получения изображения клеток с помощью световой или флуоресцентной микроскопии. Для этого отсоедините проточную камеру от проточного контура на запорном кране, чтобы перекрыть соединения крана. Для сбора проводят восемь проб для анализа.

Сначала поставьте насос на паузу, закройте запорный кран, расположенный ближе всего к гасителю импульсов. Снимите защитный колпачок, положив его вверх дном, чтобы убедиться, что он не загрязнен. Вставьте небольшой шприц в порт для образца.

Закройте запорный кран в направлении проточной камеры, держа отверстие для образца и контур в направлении демпфера импульсов открытыми. Наберите нужное количество пробы из цепи, закройте запорный кран в направлении отверстия для проб перед извлечением шприца. Храните обильный образец из восьми в промаркированном флаконе и заморозьте при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Закройте отверстие для отбора проб и убедитесь, что все запорные краны открыты, прежде чем начать подачу. Используя этот метод, эндотелиальные клетки-предшественники, полученные из человеческой крови, могут быть засажены на титановые стекла в течение 15 минут и адгезивны под действием физиологических сил сдвига. Как показано на этом рисунке, EPC распространяются под воздействием потока от примерно 210 квадратных микрон сразу после посева до примерно 657 квадратных микрон через три часа и около 1 152 квадратных микрон после 48 часов напряжения сдвига жидкости в 15 динов на квадратный сантиметр.

под световым микроскопом, иллюстрирует случайную ориентацию ЭПК человека. После статического периода сидения в течение шести часов после трех часов потока при 100 динах на квадратный сантиметр, клетки распространяются, но остаются в случайной ориентации. После 48 часов напряжения сдвига жидкости при 100 динах на квадратный сантиметр EPC выравниваются и ориентируются в направлении потока.

Здесь ЭПК были помечены КТО, а ядра клеток окрашены герксом, чтобы они погибли после вытекания. Для сравнения на этом изображении показаны свиные EPC на титановых слайдах в соответствии с направлением потока. После 48 часов потока и 15 динов на квадратный сантиметр воздействия напряжения сдвигом границы клеток окрашивали анти-PCAM, а ядра — красителем цитоксиновых нуклеиновых кислот.

Этот метод также позволяет получить образцы восьмерки PERFUSE в заранее определенные моменты времени для анализа и/или количественного определения секретируемых клеточных метаболитов. Здесь показан пример получения нитритов во время 48-часового эксперимента с EPC свиньи. При попытке этой процедуры важно поддерживать стерильность на протяжении всей процедуры.

Кроме того, важно принять необходимые меры для того, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха в проточной камере до начала непрерывного потока, так как они могут оторвать ячейки. Мы также рекомендуем проверять каждое соединение в проточной камере и контуре перед выпуском, чтобы предотвратить утечку PERFUSE eight во время эксперимента. Эта камера оснащена встроенными уплотнительными кольцами, которые обеспечивают полное противодействие верхней и нижней пластин и обеспечивают герметичное уплотнение без необходимости использования вакуумных насосов.

Эта функция также обеспечивает постоянную высоту камеры между экспериментами и устраняет необходимость в резиновых прокладках или регулировках. В нашей проточной камере используются стандартизированные предметные стекла микроскопа. Поэтому имеется большое количество клеток для дальнейших экспериментов.

Например, РНК и ДНК из клеток после потока могут быть оценены на синтез белка или экспрессию генов. Наша схема позволяет отбирать восемь образцов перфузии для анализа и количественного определения клеточных метаболитов, таких как нитрит, первичный окислительный метаболит оксида азота, который секретируется клетками под действием напряжения сдвига жидкости. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как собрать нашу проточную камеру и стерильный контур потока, чтобы подвергать ячейки сцепления напряжению сдвига жидкости.