Растяжение коротких последовательностей ДНК с постоянной силой осевой оптический пинцет

Общая цель данной процедуры заключается в манипулировании короткими молекулами ДНК длиной 100 нанометров с помощью постоянных, точно откалиброванных оптических сил. Это достигается путем прикрепления одного конца ДНК к покровному стеклу, а другого — к полистирольной микросфере. Затем проводится юстировка и калибровка оптического пинцета.

Затем ДНК оттягивается от поверхности под воздействием комбинации градиентных и рассеивающих сил, действующих на микросферу. Наконец, ДНК растягивают, фиксируя бусину в линейной области потенциала. Данный протокол использовался для изучения механических свойств ДНК и кинетики связывания ДНК с белками, а также оказался полезен для выяснения значения граничных условий для эластичности коротких конструкций ДНК.

Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, сталкиваются с определенными трудностями, так как юстировка и калибровка оптических пинцетов с постоянной силой являются сложными и трудоемкими процессами. Оптические пинцеты используют луч лазера с длиной волны 1064 нанометр, который разделяется на два взаимно ортогонально поляризованных луча. Один из них предназначен для манипулирования биомолекулой, а другой — для калибровки.

Интенсивность манипуляционного луча контролируется акустооптическим (AO) отклонителем или оптическим отклонителем (OD). Затем лучи повторно объединяются с помощью другого поляризационного светоделителя. Лучи плотно фокусируются на кювете с образцом с помощью Plan APO объектива микроскопа с масляным погружением 60 x 1.4. Данная установка оптического пинцета объединена с микроскопом светлого поля собственной сборки, в котором освещение от галогенной лампы фокусируется на камере с образцом с помощью конденсатора.

Изображение в светлом поле отделяется от лазерного излучения с помощью дихроичного зеркала, после чего проецируется на две ПЗС-камеры. Одна ПЗС-камера служит основным средством сбора данных и имеет программный триггер для обеспечения точной частоты дискретизации. Другая ПЗС-камера используется для получения изображения единственной зафиксированной эталонной микросферы, положение которой служит системой обратной связи для компенсации дрейфа микроскопа.

Образец грубо позиционируется относительно объектива с помощью XY-столика, после чего его можно точно переместить с помощью встроенного трехмерного пьезоэлектрического столика. Рассеянный вперед и прошедший лазерный свет собирается конденсором светлого поля и фокусируется на фотодетекторе для калибровки размера микросфер; заполните камеру образца дисперсным раствором полистирольных микросфер диаметром 800 nanometer, разведенных в фосфатно-солевом буфере. Оставьте систему на 10–15 minutes, затем осторожно промойте буфером.

Для удаления избыточных микросфер найдите микросферу, случайно прилипшую к покровному стеклу, и отрегулируйте высоту кюветы с образцом до тех пор, пока микросфера не окажется примерно на один микрометр ниже фокуса. Чтобы создать расфокусированное изображение для измерения видимого размера изображения с помощью LabVIEW, сначала определите центр микросферы, используя функцию геометрического сопоставления шаблонов. Затем постройте радиальный профиль интенсивности микросферы путем усреднения по 360 градусам.

Около центра каждого поперечного сечения аппроксимируйте радиальный профиль, который соответствует белому кольцу на каждом из изображений в светлом поле, с помощью квадратичной функции. Для нахождения пика яркости расстояние между этим пиком и центром может быть использовано в качестве меры кажущегося размера микросферы. Используя калиброванный пьезо-столик, постепенно изменяйте осевое положение микросферы и получайте изображение в каждой осевой позиции с помощью CCD-камеры. Повторите анализ изображений для каждого последующего снимка, чтобы сопоставить кажущийся размер микросферы с её осевым положением.

Осевое разрешение, достигаемое данным методом, составляет около 1.4 nanometers. Для картирования оптического потенциала манипуляционного пучка начните с коллинеарного выравнивания манипуляционного и калибровочного пучков при выключенном манипуляционном пучке. Удержите свободную микросферу в значительно более жесткой ловушке калибровочного пучка. Затем включите манипуляционный пучок.

Поскольку этот луч намного слабее калибровочного, осевое положение микросферы будет немного смещено. Результирующее изменение осевого положения можно измерить по изображениям в расфокусированном светлом поле, как было описано ранее. Смещайте осевой фокус и повторяйте процедуру, затем постройте график зависимости смещения delta X от осевого положения фокуса калибровочного луча.

Осевое положение, соответствующее наибольшему смещению микросферы, определяет центр линейного участка оптической ловушки. Для растяжения образца ДНК установите кювету, содержащую прикрепленные к поверхности молекулы ДНК, и, наблюдая изображение в светлом поле, с помощью телескопа установите фокус манипуляционного луча чуть выше ненатянутых микросфер, затем отрегулируйте положение предметного столика до захвата одной из микросфер. Примерно центрируйте микросферу в плоскости XY оптической ловушки, создайте в LabVIEW серию прямоугольных импульсов и подайте их на AOD для многократного включения и выключения лазерного луча.

Наблюдайте за микросферой при многократном включении и выключении ловушки. Обратите внимание, вызывает ли лазер какое-либо преимущественное направление движения микросфер при итеративной регулировке ее положения по осям X и y. При управлении пьезостановым столиком случайное движение микросферы в плоскости X-y должно стать изотропным, хотя при включенном лазере оно будет заметно ограничено.

Затем выровняйте микросферу по оси Z. Снова включайте и выключайте лазерный луч импульсно, при этом одновременно измеряя осевое смещение микросфер в режиме реального времени.

Центрируйте образец в пределах линейного участка, который представляет собой точку наибольшего смещения по оси Z при растяжении ДНК-рампы; регулируйте интенсивность лазера, подавая сигнал напряжения на A OD от 0 В до 0,5 В с шагом 0,025 В. Запишите 400 кадров с частотой 100 кадров в секунду и усредните их для получения осевого смещения. Наконец, постройте кривые зависимости силы от растяжения и аппроксимируйте их с помощью модифицированной модели полимерной цепи (worm-like chain model).

Здесь представлены кривые зависимости силы от растяжения для 2D-последовательностей НА длиной 1, 298 и 247 пар оснований для коротких участков ДНК. Общепринятая модель полимерной цепи (WLC) не полностью объясняет взаимосвязь между силой и растяжением, поскольку при таких масштабах длины необходимо учитывать эффекты конечного размера и растяжение при нулевой силе, возникающее из-за граничных ограничений. Следовательно, измерения зависимости силы от растяжения необходимо аппроксимировать с использованием модифицированной модели WLC, в которой в качестве параметров аппроксимации выступают эффективная длина персистенции и растяжение при нулевой силе, что более подробно описано в дополнительных материалах.

При большой контурной длине D-S-D-N-A эффективная длина персистенции фактически соответствует номинальной длине персистенции, составляющей около 50 нанометров, а удлинением при нулевой силе в модифицированных аппроксимациях по модели WLC можно пренебречь. Эффективные длины персистенции составляют 35 нанометров для ДНК длиной 298 базовых пар и 25 нанометров для ДНК длиной 247 базовых пар после ее разработки. Данный метод открыл путь для проведения ряда наномеханических измерений ДНК и комплексов ДНК с белками, включая исследование кинетики формирования и распада регуляторных белковых петель ДНК.