Растяжение коротких последовательностей ДНК с постоянной силой осевой оптический пинцет

Общая цель данной процедуры заключается в манипулировании короткими молекулами ДНК длиной 100 нанометров с использованием постоянных, точно откалиброванных оптических сил. Это достигается путем прикрепления одного конца ДНК к предметному стеклу, а другого — к полистирольной микросфере. Затем выполняется юстировка и калибровка оптического пинцета.

Затем ДНК растягивают от поверхности за счет комбинации градиентных и рассеивающих сил, воздействующих на микросферу. Наконец, ДНК растягивают до определенной степени, удерживая бусину в линейной области потенциала. Данный протокол использовался для изучения механических свойств ДНК и кинетики связывания ДНК с белками, а также оказался полезным при выяснении влияния граничных условий на эластичность коротких конструкций ДНК.

Как правило, специалисты, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку юстировка и калибровка оптических пинцетов с постоянным усилием являются сложными и трудоемкими процессами. Оптические пинцеты включают луч лазера с длиной волны 1064 nanometer, который разделяется на два ортогонально поляризованных луча. Один из них используется для манипулирования биомолекулой, а другой — для целей калибровки.

Интенсивность манипуляционного луча контролируется акустооптическим (AO) отклонителем или оптическим отклонителем (OD). Затем лучи объединяются с помощью другого поляризационного светоделителя. Лучи жестко фокусируются на кювете с образцом с помощью иммерсионного объектива Plan APO 60x 1,4. Эта установка оптического пинцета совмещена с собранным вручную микроскопом в светлом поле, который обеспечивает освещение от галогенной лампы, фокусируемой конденсором на камеру с образцом.

Изображение в светлом поле отделяется от лазерного света дихроичным зеркалом, после чего проецируется на две ПЗС-камеры. Одна ПЗС-камера служит основным средством сбора данных и запускается программно для обеспечения точной частоты дискретизации. Другая ПЗС-камера используется для получения изображения одной зафиксированной эталонной микросферы, положение которой служит системой управления с обратной связью для компенсации дрейфа микроскопа.

Образец грубо позиционируется относительно объектива с помощью XY-столика, после чего его положение можно точно настроить с помощью встроенного трехмерного пьезостолика. Рассеянный вперед и прошедший лазерный свет собирается конденсором светлого поля и фокусируется на фотодетекторе для калибровки размера микросфер; заполните камеру образца дисперсным раствором полистирольных микросфер диаметром 800 nanometer, разведенных в фосфатно-солевом буферном растворе. Оставьте образец на 10–15 минут, затем осторожно промойте буфером.

Чтобы удалить избыток микросфер, найдите микросферу, случайно прилипшую к покровному стеклу, и отрегулируйте высоту камеры с образцом так, чтобы микросфера находилась примерно на один микрометр ниже фокуса. Чтобы создать расфокусированное изображение для измерения кажущегося размера изображения с помощью LabVIEW, сначала определите центр микросферы, используя функцию геометрического сопоставления шаблонов. Затем постройте радиальный профиль интенсивности микросферы путем усреднения по 360 градусам.

Относительно центра каждого поперечного сечения аппроксимируйте радиальный профиль, который соответствует белому кольцу на каждом из изображений в светлом поле, квадратичной функцией. Для поиска пика яркости расстояние между этим пиком и центром можно использовать в качестве меры кажущегося размера микросферы. С помощью калиброванного пьезостолика постепенно увеличивайте осевое положение микросферы и с помощью CCD-камеры получайте изображение в каждом осевом положении. Повторите анализ изображений для каждого последующего кадра, чтобы установить корреляцию между кажущимся размером микросферы и ее осевым положением.

Осевое разрешение, достигаемое данным методом, составляет около 1,4 нанометра. Чтобы составить карту оптического потенциала манипуляционного луча, начните с коллимации и совмещения манипуляционного и калибровочного лучей при выключенном манипуляционном луче. Зафиксируйте свободную микросферу в значительно более жесткой ловушке калибровочного луча. После этого включите манипуляционный луч.

Поскольку этот луч значительно слабее калибровочного, осевое положение микросферы будет немного смещено. Возникшее изменение осевого положения можно измерить по расфокусированным изображениям в светлом поле, как было описано ранее. Сместите осевой фокус и повторите процедуру, затем постройте график зависимости смещения delta X от осевого положения фокуса калибровочного луча.

Осевое положение, соответствующее наибольшему смещению микросферы, определяет центр линейной области оптической ловушки. Для растягивания образца ДНК установите кювету, содержащую прикрепленные к поверхности молекулы ДНК, и, наблюдая изображение в светлом поле, с помощью телескопа установите фокус манипуляционного луча чуть выше ненатянутых микросфер, затем отрегулируйте положение предметного столика до тех пор, пока одна из микросфер не будет захвачена. Приблизительно позиционируйте микросферу в центре плоскости XY оптической ловушки, создайте в LabVIEW серию прямоугольных импульсов и подайте их на AOD для многократного включения и выключения лазерного луча.

Наблюдайте за микросферой в процессе многократного включения и выключения ловушки. Обратите внимание, вызывает ли лазер какое-либо преимущественное направление движения микросфер при итеративной корректировке ее положения по осям X и Y. При управлении пьезо-столиком случайное движение микросферы в плоскости XY должно стать изотропным, хотя оно будет заметно ограничено при включенном лазере.

Далее выполните юстировку микросферы по оси Z. Снова включайте и выключайте лазерный луч, при этом одновременно измеряя осевое смещение микросфер в режиме реального времени.

Центрируйте сцену в пределах линейного участка, который соответствует точке максимального смещения по оси Z при растяжении ДНК-рампы; регулируйте интенсивность лазера, подавая сигнал напряжения на A OD от 0 В до 0,5 В с шагом 0,025 В на каждом этапе. Запишите 400 кадров с частотой 100 кадров в секунду и усредните их для получения осевого смещения. В завершение постройте кривые зависимости силы от растяжения и аппроксимируйте их с помощью модифицированной модели цепочки с изгибной жесткостью (worm-like chain model).

Здесь представлены кривые зависимости силы от удлинения для последовательностей НА в 2D, длиной 1, 298 и 247 пар оснований для коротких участков ДНК. Традиционная модель полимерной цепи (WLC) не полностью объясняет зависимость силы от удлинения, поскольку при таких масштабах длины необходимо учитывать эффекты конечного размера и удлинение при нулевой силе, возникающее из-за граничных ограничений. Следовательно, измерения зависимости силы от удлинения должны быть аппроксимированы с использованием модифицированной модели WLC, в которой параметрами подгонки являются эффективная длина персистентности и удлинение при нулевой силе, что более подробно описано в дополнительных материалах.

При больших контурных длинах D-S-D-N-A эффективная персистенция равна номинальной длине персистенции, составляющей около 50 nanometers, а удлинением при нулевой силе в модифицированных аппроксимациях WLC можно пренебречь. Эффективные длины персистенции составляют 35 nanometers для ДНК длиной 298 base pair и 25 nanometers для ДНК длиной 247 base pair после её разработки. Этот метод проложил путь для ряда наномеханических измерений ДНК и комплексов ДНК с белками, включая исследование кинетики образования и распада регуляторных белковых петель ДНК.