Растяжение коротких последовательностей ДНК с постоянной силой осевой оптический пинцет

Общая цель этой процедуры заключается в манипулировании короткими молекулами ДНК длиной 100 нанометров с постоянными, хорошо откалиброванными оптическими силами. Это достигается путем привязки ДНК на одном конце к покровному листу, а на другом — к полистирольной микросфере. Далее оптический пинцет юстируется и калибруется.

Затем ДНК растягивается от поверхности с помощью комбинации градиентных сил и сил рассеяния, действующих на микросферу. Наконец, ДНК удлиняется за счет захвата шарика в линейной области потенциала. Протокол был использован для изучения механических свойств ДНК и кинетики связывания ДНК-белков, а также был полезен для выяснения важности граничных условий на эластичность коротких конструкций ДНК.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что юстировка и калибровка оптического пинцета постоянной силы сложны и сложны. Оптический пинцет включает в себя луч от лазера с яркостью 1064 нанометра, который разделен на два ортогонально поляризованных луча. Один используется для манипуляций с биомолекулой, а другой — для калибровки.

Интенсивность манипулятивного луча контролируется оптическим дефлектором AO или OD. Затем пучки рекомбинируются с помощью другого поляризационного светоделителя. Пучки плотно фокусируются с помощью объектива масляного иммерсионного микроскопа APO 60 x 1,4 на ячейку образца. Эта установка пинцета сочетается с самодельным светлопольным микроскопом, который обеспечивает освещение от галогенной лампы, направленной на камеру образца с помощью конденсатора.

Изображение в светлом поле отделяется от лазерного излучения дихроичным зеркалом, а затем выводится на две ПЗС-камеры. Одна ПЗС-матрица выступает в качестве основного средства сбора данных и запускается программным обеспечением для получения точной частоты дискретизации. В то время как другая ПЗС-матрица используется для получения изображения одной застрявшей опорной микросферы, положение которой служит системой управления обратной связью для компенсации дрейфа в микроскопе.

Образец грубо позиционируется по отношению к объективу с помощью двухкоординатного столика, а затем может быть точно позиционирован с помощью встроенного трехмерного пизонного столика. Рассеянный и прошедший вперед лазерный свет собирается конденсором светлого поля и фокусируется на фотодетекторе для калибровки размера шарика, загрузки в камеру образца дисперсного раствора полистирольных микросфер диаметром 800 нанометров, разведенных в фосфатно-солевом буфере. Дайте ему постоять от 10 до 15 минут, а затем слегка промойте буфером.

Чтобы удалить лишние микросферы, найдите микросферу, случайно прилипшую к защитному стеклу, и отрегулируйте высоту камеры образца до тех пор, пока микросфера не окажется примерно на один микрометр ниже фокуса. Чтобы создать расфокусированное изображение и измерить видимый размер изображения с помощью лабораторного просмотра, сначала найдите центр микросферы с помощью функции сопоставления геометрического узора. Затем сгенерируйте профиль радиальной интенсивности микросферы, усреднив 360 градусов.

Примерно в центре каждого поперечного сечения помещается радиальный профиль, который соответствует белому кольцу на каждом из изображений яркого поля с квадратичной функцией. Чтобы найти пик яркости, расстояние между этим пиком и центром можно использовать в качестве меры видимого размера шарика с помощью калиброванного пизонного столика, постепенно увеличивать осевое положение микросферы и получать изображение в каждом осевом положении с помощью ПЗС-камеры. Повторяйте анализ изображений для каждого последующего изображения, чтобы соотнести видимый размер микросферы с ее осевым положением.

Осевое разрешение, полученное этим методом, составляет около 1,4 нанометра для отображения оптического потенциала манипулятивного пучка, начинающегося с колина, выравнивая манипулятивный пучок и калибровочный пучок с выключенным манипулятором. Ограничьте свободную микросферу внутри гораздо более жесткой ловушки калибровочного пучка. Теперь включите манипуляционный луч.

Поскольку он намного слабее калибровочного луча, осевое положение микросферы будет немного нарушено. Результирующее изменение осевого положения может быть измерено по расфокусированным изображениям яркого поля, как уже было описано. Сместите осевый фокус и повторите график дельты смещения X относительно осевого положения фокуса калибровочного луча.

Осевое положение, соответствующее наибольшему смещению микросферы, определяет центр линейной области оптической ловушки. Для растягивания образца ДНК смонтируйте камеру, содержащую поверхностные привязанные молекулы ДНК, и во время наблюдения за изображением в ярком поле поместите фокус манипулятивного луча немного выше нерастянутых микросфер, настроив телескоп, затем отрегулируйте положение предметного столика до тех пор, пока одна из микросфер не окажется в ловушке. Грубо расположите микросферу в центре плоскости XY оптической ловушки, сгенерируйте серию прямоугольных волн в лабораторном режиме и отправьте их на внешний диаметр A для многократного включения и выключения лазерного луча.

Наблюдайте за микросферой, как ловушка многократно включается и выключается. И обратите внимание, если лазер индуцирует какое-либо предпочтительное направление движения микросфер, итеративно регулируя положение микросферы как в направлении X, так и в направлении y. Управляя пизонной стадией, случайное движение микросферы должно стать изотропным в плоскости X 5, хотя и заметно ограничиваться при включенном лазере.

Далее выровняйте бусину по оси Z. Снова включите и выключите импульс лазерного луча. При этом в это время одновременно измеряется осевое смещение микросфер в режиме реального времени.

Центрируйте столик в линейной области, которая является точкой, где смещение Z является наибольшим для растяжения рампы ДНК, интенсивность лазера путем подачи сигнала напряжения на внешний диаметр A от нуля вольт до 0,5 вольт с шагом 0,025 вольт на каждом этапе. Запишите 400 кадров со скоростью 100 кадров в секунду и усредните их, чтобы получить осевое смещение. Наконец, постройте кривые удлинения силы и подогнайте их к модифицированной модели цепи, похожей на червячку.

Здесь показаны кривые удлинения силы для 2D последовательностей NA, длиной 1 298 пар оснований и 247 пар оснований для коротких участков ДНК. Традиционная модель червеобразной цепи или WLC не полностью объясняет соотношение удлинения силы, поскольку на этих масштабах длины необходимо учитывать эффекты конечного размера и нулевое удлинение силы, возникающие из-за граничных ограничений. Таким образом, измерения удлинения усилия должны быть подобраны с использованием модифицированной модели WLC, которая имеет эффективную длину стойкости и нулевое удлинение силы в качестве параметров подгонки, описанных далее в дополнительных материалах.

Для больших длин контуров D-S-D-N-A эффективная длина персистенции равна просто номинальной длине персистенции около 50 нанометров, а удлинением нулевой силы можно пренебречь при модифицированной подгонке WLC. Эффективная длина персистенции составляет 35 нанометров для ДНК с 1 298 парой оснований и 25 нанометров для ДНК с 247 парой оснований. Этот метод проложил путь к целому ряду наномеханических измерений ДНК и белковых комплексов ДНК, включая изучение кинетики образования и разрушения петель ДНК, опосредованных регуляторными белками.