Выбор и изоляция Колонии человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из взрослых Перепрограммированный Фибробласты

В этой видеостатье фибробласты взрослого человека перепрограммированы на генерацию плюрипотентных стволовых клеток с использованием ретровирусных векторов. Во-первых, фибробласты человека трансдуцируются с помощью ретровирусных векторов, кодирующих факторы транскрипции. T три четыре, SOX два, KLF четыре и cmic.

Инфицированные фибробласты культивируют на эмбриональных питающих клетках мыши в течение 14-28 дней. Полученные культуры окрашивают антителом TRA 180 1 для идентификации колоний перепрограммированных клеток. Положительные колонии затем переносятся в MEF, содержащие пластины, для расширения.

Иммуноцитохимическое окрашивание подтверждает экспрессию маркеров плюрипотентности и создание линий плюрипотентных стволовых клеток. Затем следует провести дополнительные исследования для дальнейшей характеристики линий. Как правило, люди, не знакомые с программированием клеток соматических клеток и индуцированными плюрипотентными культурами стволовых клеток человека, испытывают трудности, потому что трудно определить правильные колонии IPSC.

Демонстрировать процедуру будет доктор Сула Поллак (Sula Pollak), пост-доктор O Fellow из моей лаборатории. Начните эту процедуру с осаждения клеток Phoenix AM FO с плотностью от 7 до 8 миллионов клеток на 10-сантиметровую пластину в 10 миллилитрах DMEM с высоким содержанием глюкозы, поместите в инкубатор и заселите на ночь. На следующий день готовят трансфекционные смеси, состоящие из 12 микрограммов вектора, кодирующего либо T, три, четыре SOX, два klf, четыре cmic или GFP гена, и 35 микролитров нескольких генов шесть в общем объеме 500 микролитров сывороточного свободного DMEM с высоким содержанием глюкозы с L-глутамином.

Выдерживайте смеси в течение 20 минут. Затем, чтобы трансфицировать клетки феникса, аккуратно пипетируйте комплексы ДНК в пластины, содержащие клетки феникса, которые должны быть на 70-80% слитыми. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов по Цельсию через шесть-восемь часов.

Аспирируйте среду и замените ее восемью миллилитрами DMEM с высоким содержанием глюкозы с антибиотиками. Затем верните планшеты в инкубатор на 12 часов после инкубации. Используйте пипетку для аспирации и сбора вируссодержащей среды.

Затем замените среду и повторяйте этот процесс каждые 12 часов, пока среда не будет собрана четыре раза. Храните среду при температуре четыре градуса по Цельсию. После того, как вся среда будет собрана, соедините все порции, затем вылейте ее через верхний фильтр с трубкой 0,45 микрометра в коническую трубку объемом 50 миллилитров, чтобы удалить отделившиеся клетки и мусор.

Отфильтрованную среду, которая содержит вирусные частицы, можно хранить в холодильнике в течение двух недель без потери инфекционной активности. Замораживать не рекомендуется. За день до процедуры трансдукции разморозьте замороженный запас фибробластов взрослого человека и добавьте по одному разу по 10 к пятым клеткам в каждую лунку из шести хорошо покрытых желатином пластин.

На следующий день в конической трубке объемом 50 миллилитров соедините по 3,5 миллилитров с четырьмя T SOX 2, klf four и CMIC вирусной средой и добавьте Poly Brain до конечной концентрации в шесть микрограммов на литр в качестве контроля. Приготовьте один миллилитр вирусной среды GFP, три миллилитра культуры, среду и полимозг в конечной концентрации шесть микрограммов на миллилитр. Аспирируйте среду из пластины, содержащей фибробласты человека.

Затем добавьте четыре миллилитра смешанной вирусной среды или контрольной среды, центрифугируйте планшеты при температуре 1600 G в течение одного часа при температуре 20 градусов по Цельсию после центрифугирования. Инкубируйте пластины примерно 12 часов. Затем замените вирусную среду питательной средой для фибробластов и инкубируйте еще 12 часов.

Повторите этот процесс от инфицирования до посева в среду фибробластов, еще два раза после последнего заражения. Культивируйте фибробласты в DMEM в течение 48 часов. Затем проверьте эффективность инфицирования параллельных трансдукций ретровирусной средой GFP.

Далее инициировать перепрограммирование с соматических на плюрипотентные клетки. Инфицированные фибробласты культивируют в среде эмбриональных стволовых клеток человека или в среде HES в эмбрионах мыши, фибробластах или MEF в плотности примерно от двух до 10-5 клеток на лунку обработанного желатина. Шесть лунок в среду для роста фибробластов на следующий день.

Разделите инфицированные человеческие фибробласты с помощью 0,05% трипсина ЭДТА и засейте их в плотности примерно 1,2 умножить на 10 до четвертой лунки в питательной среде фибробластов. На следующий день. Замените среду средой HES, содержащей 0,5 миллимолярного бутирата натрия, в течение первых семи дней после перепрограммирования.

Меняйте среду ежедневно. Замените среду на среду HES без бутирата натрия и продолжайте перепрограммирование еще от семи до 21 дня. Меняйте среду ежедневно каждый день.

Проверьте трансдуцированные клетки на предмет морфологических изменений. Колонии клеток начнут появляться примерно через 10 дней после переноса трансдуцированных фибробластов на фидерные клетки. Колонии, содержащие перепрограммированные клетки, теперь называются индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками человека или человеческими IPS-клетками.

Колонии человеческих IPS-клеток будут готовы к выделению через 14-28 дней после их размещения на фидерных клетках MEF. На этом этапе колонии человеческих IPS-клеток могут быть перенесены либо на MEF-содержащие, либо на пластины, покрытые матригелами. Перенос на MEF-содержащие планшеты демонстрируется за сутки до выбора колоний IPS-клеток человека Засейте 24-луночные планшеты, содержащие гамма-облученные MEF-фидерные клетки в среде для роста фибробластов.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2 в день, когда будут собраны колонии человеческих IPS-клеток. Аспирируйте питательную среду фибробластов из МЭ Fs и промойте их PBS, чтобы удалить любые следы FBS. Затем добавьте 0,5 миллилитра эмбриональной стволовой клетки человека или среды HES, содержащей 10 микромолярного ингибитора породы Y 2 7 6 3 2 Затем с помощью микроскопа, установленного в ламинарном проточном колпаке, исследуйте перепрограммирующие планшеты для формирования колонии IPS-клеток человека.

При необходимости удалите фибробласты, окружающие колонии IPS-клеток человека, с помощью иглы 21 калибра. Промойте планшеты PBS и добавьте свежую среду HES, содержащую специфическое антитело TRA 180 1 для окрашивания живого. Верните клетки в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.

Через 30 минут замените среду на свежую среду HES с добавлением 10 микромолярного ингибитора породы. Затем осмотрите колонии под флуоресцентным микроскопом. Отметьте TRA от одного до 81 положительной колонии.

Использование маркера объектива с помощью иглы 21 калибра. Разрежьте колонии человеческих IPS-клеток TRA 180 1 на несколько небольших частей. Далее с помощью автоматической пипетки перенесите фрагменты колоний клеток IPS человека в отдельные лунки 24-луночного планшета с ME Fs. Избегайте переноса не-IPS клеток.

Поместите планшеты в инкубатор и дайте человеческим колониям клеток IPS прикрепиться в течение 24-36 часов, ежедневно меняя среду. Колонии человеческих IPS-клеток с правильной морфологией, подобной HE, будут видны через 48 часов после первоначального переноса на 24-луночную пластину. Выращивание культур на 12 лунок и затем на шестилуночный планшет после клонального расширения.

И создание человеческих клеточных линий IPS анализирует экспрессию маркеров плюрипотентности TRA one, 60 SSEA четыре, T 3, 4, SOX two и nanog с использованием иммунохимии после того, как линии были установлены. Детальная характеристика может повлечь за собой in vitro и in vivo. Дифференцировочный анализ, анализ кариотипа, анализ исследований сайленсинга метилирования трансгенов и исследования экспрессии генов.

Эффективная трансдукция ретровируссодержащей средой имеет решающее значение для успешного перепрограммирования для определения эффективности вирусной трансдукции. Фибробласты взрослого человека, полученные от пациента с атаксией Фридрихса, были визуализированы после двух последовательных инфекций ретровирусной средой GFP, когда фибробласты были инфицированы простой инкубацией с вирусной средой, трансдуцируется менее 20% клеток. Однако, когда сразу же последовало добавление ретровирусных сред GFP, эффективность трансдукции резко возросла.

Здесь более 80% клеток трансдуцируются для проведения первичной характеристики изолированных колоний IPS-клеток человека. Экспрессия маркеров плюрипотентности, характерных для ЭС-клеток человека, оценивалась с помощью иммунохимии, как показано здесь. Изолированные колонии IPS-клеток человека были положительными на маркеры плюрипотентности.

T три, четыре, SOX два нано, SSEA четыре и TRA один 60 ДНК. Окрашивание Cos с помощью DPI, показанное на верхних панелях, обнаруживается как в колониях IPS-клеток человека, так и в фидерных клетках. Эти результаты демонстрируют, что IPS-клетки человека, полученные с использованием этого протокола перепрограммирования, экспрессируют соответствующие маркеры плюрипотентности, характерные для недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как успешно перепрограммировать человеческий фибробласт в плюрипотентные стволовые клетки с помощью ретровирусной транзакции, идентифицированной правильной индукцией человека, колониями плюрипотентных стволовых клеток, и провести первоначальную характеристику HI-ПК.