Электрофизиологические характеристика GFP-выражая клеточных популяций в Неповрежденный Retina

Общая цель данной процедуры — изучение световых реакций и морфологии отдельных нейронов в интактной сетчатке с использованием линии мышей, экспрессирующей флуоресцентный маркер исключительно в специфических типах клеток. Это достигается путем предварительного препарирования глаза для получения изолированной сетчатки. Вторым этапом является помещение сетчатки под лазерный сканирующий микроскоп и визуализация клетки с помощью двухфотонного инфракрасного возбуждения.

Затем с помощью микропипетки создается конфигурация «whole-cell patch clamp» для регистрации сигналов и введения красителя. В конечном итоге такая подготовка позволяет регистрировать клеточные ответы на фотостимуляцию и визуализировать морфологию регистрируемой клетки с помощью конфокальной микроскопии. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как «слепая» патч-зажимная запись с сетчатки, является возможность визуально нацеливать запись на флуоресцентно меченную клетку, не подвергая при этом стимуляции всю сетчатку возбуждающим светом.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях сетчатки, например, каков вклад определенной популяции клеток в обработку визуальной информации? Это применимо даже в тех случаях, когда плотность популяции клеток низка и они не обладают выраженными морфологическими признаками, которые могли бы облегчить идентификацию. Перед началом эксперимента подвергните мышь адаптации к темноте в течение не менее трех часов.

Тем временем приготовьте внеклеточный раствор согласно описанию в прилагаемой статье и продуйте его карбогеном при комнатной температуре. Затем подвергните мышь эвтаназии и вылуните глаза с помощью пары изогнутых ирисных ножниц. Перенесите их в чашку с внеклеточным раствором.

Затем поместите глаз под диссекционный микроскоп и с помощью подпружиненных ножниц удалите роговицу и цилиарное тело, вскрыв глазное яблоко по зубчатому краю (ora serrata). Извлеките хрусталик и осторожно отделите сетчатку от пигментного эпителия.

После этого перережьте зрительный нерв между сетчаткой и пигментным эпителием. Извлеките сетчатку из глазного яблока. Обратите внимание, что внутренняя сторона свернутой сетчатки — это сторона ганглионарных клеток.

Внешняя сторона — это сторона фоторецепторов. Затем удалите стекловидное тело с внутренней поверхности сетчатки, осторожно оттянув его с помощью деревянной зубочистки. После этого сделайте короткие надрезы по периметру сетчатки, чтобы облегчить распластывание ткани.

Затем перенесите сетчатку в измерительную камеру стороной фоторецепторов вниз. Расправьте её по стеклянному дну с помощью тонкой кисти и зафиксируйте с помощью стальной рамки с нейлоновыми нитями. Поместите измерительную камеру в темноту под вертикальный лазерный сканирующий микроскоп.

Осуществляйте непрерывную суперперфузию препарата сетчатки со скоростью не менее 5 мл/мин. Используйте оксигенированный внеклеточный раствор, подогретый до 35 °C; микроскоп должен быть установлен на виброизоляционном пневматическом столе внутри клетки Фарадея. Для обеспечения электронной защиты и поддержания темноты накройте клетку непрозрачной завесой.

Мы также экранируем свет от мониторов компьютеров красными прозрачными пленками. Настройте инфракрасный лазер на длину волны от 850 до 870 нанометров или на более длинные волны. Перейдите в режим синхронизации мод и используйте двухфотонное возбуждение для визуализации клеток, экспрессирующих GFP.

Для проведения локальной фиксации потенциала (patch clamp) заполните микропипетки из боросиликатного стекла внутриклеточным раствором, содержащим флуоресцентный зонд, как описано в прилагаемой рукописи. Затем вставьте микропипетку в держатель. Убедитесь, что электрод сравнения контактирует с внеклеточным раствором в регистрирующей камере.

Затем, используя объектив для погружения в воду с 40-кратным увеличением, прижмите микропипетку к целевой клетке, экспрессирующей GFP. Тела клеток Omicron расположены в слое ганглионарных клеток, а также в проксимальной части внутреннего сетчаточного слоя; перед тем как микропипетка вступит в контакт с целевой клеткой, необходимо проколоть внутреннюю пограничную мембрану на поверхности сетчатки. Успешное проникновение определяется по выходу внутриклеточного раствора из кончика микропипетки и отслоению внутренней пограничной мембраны от подлежащей ткани сетчатки. Флуоресцентный краситель в составе внутриклеточного раствора позволяет отслеживать положение микропипетки на двухфотонном изображении при приближении к нужной клетке.

Затем сбросьте давление из микропипетки, чтобы добиться конфигурации whole-cell patch clamp. В режиме фиксации тока (current clamp) пригодная для записи запись должна демонстрировать мембранный потенциал от минус 50 до минус 55 мВ и продолжаться не менее 20 минут. После этого предъявите визуальные стимулы, созданные на компьютерном мониторе.

Отрегулируйте интенсивность стимула, вставив нейтральные светофильтры в путь луча, и совместите пространственное положение стимуляции с центром регистрируемой клетки. Затем запустите протокол стимуляции и запишите световые ответы. Используйте генератор стимулов для запуска программы записи.

Разместите фотодиод на пути луча для регистрации времени подачи стимула. Будьте осторожны, чтобы не вытянуть тело клетки при извлечении микропипетки. После завершения заполнения красителем дайте флуоресцентному агенту диффундировать в регистрируемую клетку в течение 30–45 минут.

Ниже представлен пример клеток, экспрессирующих GFP, в препарате сетчатки (метод flat mount) под управлением их промотора. Для тирозингидроксилазы можно выделить две популяции клеток по яркости сигнала GFP. Дофаминергические клетки первого типа, расположенные в внутреннем ядерном слое, проявляют слабую флуоресценцию, что отмечено наконечниками стрелок на рисунке A. Клетки второго типа интенсивно окрашены; их тела расположены либо в этом же слое, как показано стрелками на рисунке A, либо смещены в ганглионарный слой, как показано на рисунке B. На рисунке C представлена дендритная стратификация клеток второго типа в третьем слое внутреннего сетчатого слоя. Здесь приведен пример морфологии клетки второго типа, в которую был введен трейсер нейробиотин.

Позже метку визуализировали путем связывания с флуоресцентно меченным стрептавидином, который здесь показан пурпурным цветом. Здесь представлены различные паттерны ответа клетки второго типа, расположенной в слое ганглионарных клеток, на белый свет. Для лучшего разграничения компонентов ответа в моменты начала и прекращения стимуляции в ходе данной процедуры использовался продолжительный стимул длительностью три секунды.

Для ответа на дополнительные вопросы, например, о функциональной роли определенного типа клеток в сетчатке глаза, можно использовать другие методы, такие как фармакологические эксперименты, кальциевый имиджинг или иммунохимия.