Электрофизиологические характеристика GFP-выражая клеточных популяций в Неповрежденный Retina

Общая цель этой процедуры заключается в изучении световых реакций и морфологии отдельных нейронов в интактной сетчатке с помощью мышиной линии, которая экспрессирует флуоресцентный маркер исключительно в определенных типах клеток. Это достигается путем предварительного препарирования глаза для получения изолированной сетчатки. Второй шаг — поместить сетчатку глаза под лазерный сканирующий микроскоп и визуализировать клетку с помощью двухфотонного инфракрасного возбуждения.

Затем с помощью микропипетки получают конфигурацию клеточного патч-хомута для записи и заполнения красителя. В конечном счете, этот препарат позволяет регистрировать клеточные реакции на фотостимуляцию и выявляет морфологию зарегистрированной клетки с помощью конфокальной микроскопии. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как неуправляемая запись с сетчатки, заключается в том, что запись может быть визуально направлена на флуоресцентно меченую клетку без стимуляции сетчатки возбуждающим светом.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях сетчатки, например, каков вклад данной популяции клеток в обработку визуальной информации? Даже если популяция клеток имеет низкую плотность и не несет каких-либо отчетливых морфологических особенностей, которые могут облегчить идентификацию. Начните этот эксперимент с адаптации мыши в темноте в течение как минимум трех часов перед экспериментом.

Тем временем приготовьте внеклеточный раствор, как описано в прилагаемой рукописи, и смешайте его с карбогеном при комнатной температуре. Затем принесите мышь в жертву и зажмите глаза с помощью изогнутых ножниц для радужной оболочки. Переложите их в чашку с внеклеточным раствором.

Затем поместите его под рассекающий микроскоп с помощью пружинных ножниц. Удалите роговицу и цилиарное тело, открыв глазную луковицу вдоль пильчатой ауры. Выньте хрусталик и аккуратно отделите сетчатку от пигментного эпителия.

После этого перережьте зрительный нерв между сетчаткой и пигментным эпителием. Извлеките сетчатку из наглазника. Обратите внимание, что внутренняя часть свернутой сетчатки является стороной ганглиозных клеток.

Внешняя сторона – это сторона фоторецептора. Впоследствии удалите стекловидное тело с внутренней поверхности сетчатки, аккуратно оттянув его с помощью деревянной зубочистки. Затем наложите короткие разрезы по периметру сетчатки, чтобы облегчить уплощение ткани.

Далее перенесите сетчатку в записывающую камеру фоторецептором вниз. Разложите его на стеклянном дне тонкой щеткой и обездвижьте с помощью нейлоновой натянутой рамки из нержавеющей стали. Поместите записывающую камеру в темноте под вертикальный лазерный сканирующий микроскоп.

Супер плавите препарат сетчатки непрерывно со скоростью не менее пяти миллилитров в минуту. С помощью автомобильного кислородосодержащего внеклеточного раствора, нагретого до 35 градусов Цельсия, микроскоп расположен на амортизирующем воздушном столе внутри клетки Фарадея. Для электронного экранирования накройте клетку непрозрачной завесой, чтобы сохранить подготовку и темноту.

Также мы экранируем свет от мониторов компьютеров красными прозрачными пленками. Настройте инфракрасный лазер на длину волны от 850 до 870 нанометров или больше. Переключитесь в состояние блокировки режима и используйте двухфотонное возбуждение для визуализации клеток, экспрессирующих GFP.

Для записи с помощью патч-клэмпа заполните микропипетки из силикатного стекла боро внутриклеточным раствором, содержащим флуоресцентный зонд, как описано в прилагаемой рукописи. Затем вставьте микропипетку в держатель. Убедитесь, что электрод сравнения находится в контакте с внеклеточным раствором в записывающей камере.

Затем надавите на мишень микропипетки Экспрессирующую GFP клетку с помощью объектива с 40-кратным погружением в воду, тела клеток Omicron расположены в слое ганглиозных клеток, а также в проксимальной части промежуточного слоя, прежде чем контакт микропипетки с целевой клеткой проникнет во внутреннюю пограничную мембрану на поверхности сетчатки. Успешное проникновение распознается по внутриклеточному раствору, который вытесняется из наконечника микропипетки, и отслоению внутренней пограничной мембраны от подлежащей ткани сетчатки. Флуоресцентный краситель во внутриклеточном растворе может выявить положение микропипеток на двухфотонном изображении при приближении к нужной клетке.

Затем сбросьте давление с микропипетки и получите конфигурацию зажима для целой ячейки. В режиме токовых зажимов пригодная для использования запись должна давать мембранный потенциал от минус 50 до минус 55 милливольт и длиться не менее 20 минут. После этого предъявите визуальные стимулы, созданные на мониторе компьютера.

Настройте интенсивность стимула, вставив фильтры нейтральной плотности в траекторию луча, и отрегулируйте пространственное положение стимуляции по центру регистрируемой ячейки. Затем запустите протокол стимуляции и запишите реакцию света. Используйте генератор стимулов для запуска программного обеспечения для записи.

Включите фотодиод в траекторию луча, чтобы записывать время возбуждения. Будьте осторожны, чтобы не вытащить тело клетки при втягивании микропипетки. Когда это будет сделано для заполнения красителем, дайте флуоресцентному агенту диффундировать в записанную ячейку в течение 30-45 минут.

Вот пример клеток, экспрессирующих GFP в плоскости сетчатки под их промотором Для тирозингидроксилазы можно различить две популяции по яркости сигнала GFP. Дофаминергические клетки первого типа, расположенные в промежуточном слое, проявляют слабую флуоресценцию, как показано стрелками. На рисунке А. Клетки второго типа были интенсивно помечены и имеют клеточные тела либо в слое, как показано стрелками на рисунке А, либо смещены в слое ганглиозных клеток, как показано на рисунке В, на рисунке С показана дендритная стратификация клеток второго типа в третьем слое внутреннего плексиформного слоя.

Позже индикатор был визуализирован путем связывания с флуоресцентно меченным стрептавидином, который показан здесь пурпурным цветом. Здесь представлены различные паттерны реакции клетки второго типа, расположенной в слое ганглиозных клеток, на белый свет. Пролонгированный стимул продолжительностью три секунды использовался для лучшего различения компонентов ответа при стимуле, начале и смещении после этой процедуры.

Другие методы, такие как фармакологические эксперименты, визуализация кальция или иммунохимия, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как функциональная роль данного типа клеток в схеме сетчатки.