Прямая Обнаружение ацетат формирования Деятельность киназы ацетат Фермент
19 декабря 2011 г.
Метод определения активности киназы ацетат описывается. Этот тест использует прямой реакции для определения активности ферментов и кинетики ацетат киназа в ацетат формирования направления с различными фосфорильной акцепторов. Кроме того, этот метод может быть использован для опробования других ацетил фосфата или ацетил-КоА использованием ферментов.
Целью данного эксперимента является прямое измерение ацетат-образующей активности ацетаткиназы. Запустите реакцию, добавив фермент в реакционную смесь, содержащую ацетилфосфат и DP-субстраты. Затем добавьте гидрохлорид гидроксиламина, чтобы перевести оставшийся ацетилфосфат в ацетилгидроксилат.
Добавьте проявитель, чтобы превратить ацетилгидроксилат в окрашенный комплекс гидроксилата железа(III), который можно измерить спектрофотометрически. Результаты, основанные на количестве ацетилфосфатного субстрата, потребленного в реакции, позволяют определить кинетические параметры фермента. Преимущество данной методики перед существующими методами заключается в том, что она основана на прямом измерении потребления ацетилфосфата, а не на связывании продукции ATP с восстановлением ADP. Поскольку этот анализ не зависит от продукции ATP, он может быть использован для новой группы ацетаткиназ, которые производят неорганический фосфат вместо ATP. Для построения стандартной кривой из шести-восьми точек разбавьте исходный раствор ацетилфосфата в 100 mM TRIS до конечного объема образца 300 µL; также включите контрольный образец без ацетилфосфата. Выдержите все образцы в термостате при 37 °C в течение одной минуты.
Теперь добавьте 50 µL 2 M гидроксиламина гидрохлорида, перемешайте, встряхнув пробирку три раза, и инкубируйте в термоблоке при 60 °C в течение пяти минут. Затем добавьте 100 µL раствора для проявления, перемешайте, встряхнув три раза, и дайте цвету развиться в течение как минимум одной минуты при комнатной температуре. Центрифугируйте образцы, используя пластиковые кюветы для спектрофотометра.
Измерьте образцы при 540 нанометрах. С помощью подходящего программного обеспечения для анализа данных и построения графиков постройте стандартную кривую зависимости абсорбции при 540 нанометрах от микромолей ацетилфосфата. Вычислите значение коэффициента детерминации r².
Распределите по 300 µL аликвоты реакционной смеси в микроцентрифужные пробирки. Не забудьте включить контрольную реакцию без фермента. Выдержите пробирки в течение одной минуты при 37 °C. Если проводится несколько реакций, добавляйте фермент в пробирки через определенные интервалы времени и немедленно возвращайте каждую пробирку в нагревательный блок при 37 °C.
Через пять минут добавьте 50 µL 2 M гидрохлорида гидроксиламина, перемешайте и инкубируйте в течение пяти минут при 60 °C. Затем добавьте 100 µL раствора для проявления, перемешайте и оставьте при комнатной температуре для развития окраски. После этого центрифугируйте образцы при 18 000 ×g в течение одной минуты.
Затем измерьте оптическую плотность при 540 нанометрах. Определите количество присутствующего ацетилфосфата путем сравнения с калибровочным графиком ацетилфосфата. Данные можно построить на графике и аппроксимировать уравнением Маккейлы-Цементина для определения кинетических параметров.
Данный анализ определяет потребление субстрата ацетилфосфата для измерения активности ацетаткиназы в направлении образования ацетата. Ацетилфосфат, остающийся по истечении определенного времени ферментативной реакции, превращается в ацетилоксибат и впоследствии в комплекс гидроксиацетата с железом (III), который имеет красноватый цвет, интенсивность которого можно измерить при 540 нм. Типичная калибровочная кривая, представляющая зависимость оптической плотности при 540 нм от микромолей ацетилфосфата, имеет наклон 1,2332 единицы оптической плотности на микромоль ацетилфосфата.
Полученное значение R² равное 0,99 указывает на хорошее соответствие данных линейному уравнению, представленному здесь. Этот анализ может быть использован для определения KM ацетилфосфата для различных препаратов фермента. При концентрации 5 мМ DP с варьирующимися концентрациями ацетилфосфата очищенная рекомбинантная ацетаткиназа из methanol Sarina thermophilic демонстрирует стандартную кинетику типа Майклалиса-Ментен для каждого субстрата, что приводит к кажущемуся значению KM 0,27 ± 0,01 мМ ацетилфосфата.
В отличие от стандартного сопряженного анализа, данный прямой метод позволяет измерять активность ацетаткиназ, использующих субстраты, отличные от TP. Например, при использовании ацетилфосфата пирофосфат-продуцирующей ацетаткиназой из Entamoeba histolytica в реакционную смесь вместо DP добавляли фосфат натрия. Полученная кривая указывает на кажущееся значение KM, равное 0,50 ± 0,006 мМ ацетилфосфата. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как напрямую измерять активность ацетаткиназы путем определения количества потребленного ацетилфосфата.
Ключевым фактором получения воспроизводимых результатов является строгое соблюдение единообразия на каждом этапе, особенно при добавлении фермента и в процессе перемешивания.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод прямого измерения активности ацетаткиназы с акцентом на кинетику реакции в направлении образования ацетата. Данный анализ может быть также адаптирован для других ферментов, использующих ацетилфосфат или ацетил-CoA.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Кинетика ферментов
- Метаболические пути
Теоретические сведения
- Ацетаткиназа играет важную роль в метаболических процессах.
- Традиционные методы измерения ферментативной активности могут быть неприменимы для всех ацетаткиназ.
- Методы прямого измерения позволяют получить более точные кинетические параметры.
- Данный метод позволяет изучать новую группу ацетаткиназ.
Цель исследования
- Разработать прямой метод измерения активности ацетаткиназы.
- Определить кинетику фермента на основе потребления ацетилфосфата.
- Предложить метод, применимый к различным ферментам, использующим ацетилфосфат.
Используемые методы
- Запустите реакцию, добавив фермент в смесь, содержащую ацетилфосфат и субстраты DP.
- Добавьте гидрохлорид гидроксиламина, чтобы перевести оставшийся ацетилфосфат в ацетилгидроксилат.
- Используйте проявитель для образования окрашенного комплекса с целью последующего измерения.
- Проведите спектрофотометрическое измерение для определения количества израсходованного субстрата.
Основные результаты
- Данный анализ позволяет напрямую измерять активность ацетаткиназы.
- Он обеспечивает получение надежных кинетических параметров на основе потребления субстрата.
- Метод может быть адаптирован для других ферментов, использующих ацетилфосфат.
- Он преодолевает ограничения существующих методов, основанных на продукции ATP.
Выводы
- Данный метод углубляет понимание кинетики ацетаткиназы.
- Он открывает возможности для изучения более широкого спектра ацетаткиназ.
- Методы прямого измерения позволяют усовершенствовать анализы ферментативной активности.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный прямой метод анализа активности ацетаткиназы позволяет проводить точную кинетическую характеристику путем измерения расхода ацетилфосфата, что позволяет преодолеть ограничения сопряженных анализов, зависящих от ATP. Метод способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков для ферментов, использующих альтернативные доноры фосфорильных групп, расширяя спектр потенциальных лекарственных мишеней в микробном метаболизме. Данный подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет получения воспроизводимых количественных данных для идентификации ведущих соединений и исследования метаболических путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функцию ацетаткиназы в направлении синтеза ацетата, что проясняет роль метаболических путей и значимость мишени.
- Практическая ценность: предоставляет метод анализа, не зависящий от сопряжения, который применим к различным ацетаткиназам, включая те, которые производят PPi вместо ATP.
- Прогностическая ценность: способствует определению кинетических параметров (KM, Vmax) для оптимизации ведущих соединений и приоритизации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные о потреблении ацетилфосфата для надежного скрининга соединений и профилирования ингибиторов.
- Практическая ценность: использование спектрофотометрического считывания при 540 nm обеспечивает возможность адаптации для высокопроизводительного анализа и стандартизации метода.
- Масштабируемость: построение стандартной кривой с r2 > 0.99 гарантирует воспроизводимость результатов в различных экспериментах и лабораториях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: связывает кинетику ферментов с метаболическим потоком у таких патогенов, как Entamoeba histolytica, что способствует валидации мишеней для противомикробных препаратов.
- Снижение механистических рисков: уточняет субстратную специфичность и каталитическую эффективность, уменьшая неопределенность в гипотезах о взаимодействии с мишенью.
- Непрерывность путей: обеспечивает доклиническое моделирование механизмов вирулентности, зависящих от ацетаткиназы.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный анализ вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, предоставляя кинетические данные, которые используются при оптимизации хитов в лиды и выборе доклинических кандидатов.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о функции ацетаткиназы в энергетическом обмене и путях вирулентности.
- Скрининг: предоставляет количественные спектрофотометрические данные, позволяющие проводить надежную оценку соединений и разработку SAR.
- Аналитика: позволяет определять кинетические параметры (KM, Vmax) с помощью аппроксимации по уравнению Михаэлиса-Ментен для проведения сравнительного энзимологического анализа различных вариантов фермента.
- Трансляционные исследования: связывает активность фермента с системами, имеющими значение для патогенеза заболеваний, в частности, с анаэробными патогенами, использующими ацетаткиназу для генерации ATP/PPi.
- Повторное использование в корпоративном секторе: создает многократно используемую платформу для характеристики ферментов, использующих ацетилфосфат, в различных целевых семействах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прямое измерение потребления субстрата повышает достоверность прогнозов относительно вовлеченности целевого механизма и пути.
- Операционная ценность: Устраняет зависимость от сопряженных ферментов, упрощая рабочий процесс и снижая вариабельность реагентов.
- Стратегическая ценность: Позволяет проводить характеристику неканонических ацетаткиназ, расширяя пространство поиска мишеней и повышая точность принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации мишеней с учетом рисков на основе подтвержденных кинетических профилей и ясности механизма действия.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области кинетики ферментов и разработки спектрофотометрических методов анализа.
- Необходим доступ к спектрофотометру с возможностью измерения при 540 nm и стандартному лабораторному оборудованию для инкубации.
- Для получения воспроизводимых результатов требуется строгое соблюдение времени и интенсивности перемешивания при добавлении гидроксиламина гидрохлорида и проявителя.
- Необходимо адаптировать диапазоны концентрации субстрата ацетилфосфата в зависимости от значений KM целевого фермента.
- Метод ограничен ферментами, использующими ацетилфосфат в качестве субстрата; не применим к киназам, действующим на другие субстраты.
