Раскрывающееся кальмодулина-связывающие белки

Общая цель данной процедуры — протестировать белки, которые связываются с кальмодулином кальций-зависимым образом. Это достигается путем предварительного сбора интересующих белков. Затем подготавливают салфетки с кальмодулином для связывания белков.

Затем белки инкубируют с серологическими бусинами с кальмодулином. В завершение элюируют белки, которые связываются в кальций-зависимой манере. В итоге с помощью вестерн-блоттинга можно получить результаты, демонстрирующие белки, которые связываются с кальмодулином как в присутствии, так и в отсутствие кальция.

Основным преимуществом данного метода перед другими существующими способами, такими как кальмодлиновая хроматография и иммунопреципитация, является то, что он требует меньшего количества белка и затрачивает меньше времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сигналинга кальмодулина, например, какие белки связываются с кальмодулином кальций-зависимым образом и как посттрансляционные модификации могут влиять на их связывание с кальмодулином. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы работы с гранулами являются принципиальными, а описание процесса ресуспендирования и удерживания гранул трудно понять без наглядного представления.

Для подготовки ткани к гомогенному введению в органотипические срезы гиппокампа используйте вирус, содержащий плазмиду, экспрессирующую интересующий рекомбинантный белок. В данном примере рекомбинантным белком является Neuro Grandin с GFP-меткой. После вирусной инъекции оставьте ткань для экспрессии белка на ночь, примерно на 12–18 часов, затем добавьте один миллилитр буфера для диссекции в чашку Петри.

Перенесите культивируемую ткань вместе с вставкой в чашку Петри и с помощью скальпеля добавьте в вставку два миллилитра диссекционного буфера, чтобы погрузить ткань. Соберите от пяти до 10 органотипических срезов ткани гиппокампа, аккуратно отделяя ткань от мембраны вставки с помощью инвертированной пастернауской пипетки. Перенесите суспендированную ткань в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Затем центрифугируйте образцы при 1500 RCF в течение одной минуты. Чтобы отделить ткань от буфера для диссекции, осторожно удалите супернатант с помощью аспирации. Следите за тем, чтобы не повредить осадок.

Для каждого используемого среза перенесите ткань в 30–60 µL гомогенизационного буфера с помощью одномиллилитрового дозатора с обрезанным наконечником, затем тщательно гомогенизируйте образец с помощью пестика, после чего перенесите гомогенат обратно в исходную пробирку. Для удаления клеточного дебриса центрифугируйте полученный гомогенат при 1100 RCF в течение 10 минут и осторожно соберите супернатант путем аспирации, избегая загрязнения осадком. Отоберите аликвоту 10% супернатанта в качестве образца исходного материала (input).

Храните оставшуюся супернатант на льду во время подготовки кал-серо-бидсов к использованию. Позже, для каждого цикла осаждения, перенесите пипеткой 400 µL суспензии кал-модлин-серо-бидсов в микроцентрифужную пробирку объемом 2 mL с относительно плоским дном, чтобы максимально увеличить площадь поверхности и взаимодействие растворов с бидсами во время инкубации; положите микроцентрифужную пробирку на бок, чтобы смочить бидсы, а затем центрифугируйте их при 21 000 RCF в течение 30 секунд.

Осторожно удалите супернатант с помощью аспирации. Следите за тем, чтобы не потревожить гранулы. Промойте гранулы 100 µL соответствующего гомогенизационного буфера, содержащего либо 2 mM хлорида кальция (для гранул, используемых для осаждения белков, связывающих кальций-кальмодулин), либо 2 mM ЭДТА, известного хелатора кальция (для гранул, используемых для осаждения белков, связывающих апо-кальмодулин).

Осторожно постучите по пробирке для ресуспендирования. Взвесьте гранулы и центрифугируйте при 1500 RCF в течение одной минуты. Осторожно удалите супернатант с помощью аспиратора, стараясь не потревожить гранулы, чтобы связать белки с кальмодулин-сферонами для осаждения.

Начните с разделения супернатанта (SNAT) на два равных объема. В зависимости от условий для каждой аликвоты добавьте в супернатант соответствующее количество хлорида кальция или ЭДТА до конечной концентрации 2 мМ. Добавьте супернатант к промытым микросферам в соответствующем буфере для гомогенизации.

Осторожно постучите по пробирке для перемешивания. Инкубируйте образцы при температуре 4 °C в течение трех часов на шейкере. Примерно каждые 30 минут мы ресуспендируем гранулы для повышения эффективности связывания.

Затем центрифугируйте образцы при 1500 RC F в течение трех минут. Отберите 50 µl супернатанта в качестве образца несвязанного белка, после чего осторожно удалите оставшийся супернатант путем аспирации и утилизируйте его. Промойте гранулы трижды, как и прежде, используя 100 µl соответствующего буфера для гомогенизации.

Самым сложным этапом данной процедуры является эффективное элюирование целевых белков. Чтобы обеспечить успех, рекомендуется использовать подходящие пробирки для минимизации потери гранул и предварительно нагреть буфер для элюирования перед соответствующим ресуспендированием гранул в нем. Это также может существенно помочь процессу элюции. Добавьте 50 µL буфера для элюирования к гранулам, чтобы элюировать белок.

Образцы, которые были гомогенизированы и связаны в буфере, содержащем кальций, переводят в буфер, содержащий EDTA, а образцы, находившиеся в буфере с EDTA, переводят в буфер с кальцием. Инкубируйте бусины при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере. Перемешивайте бусины, осторожно постукивая по пробирке примерно каждые пять минут.

Центрифугируйте гранулы при 1500 RCF в течение трех минут и осторожно удалите 50 µL SNAT для образца связанного белка с помощью аспирации. Следите за тем, чтобы не потревожить осадок гранул. Проведите SDS-PAGE и вестерн-блоттинг для идентификации искомого белка в качестве положительного контроля в противоположном условии.

Белок Prop Pro известен своей способностью связываться с Cal Modlin. На этом рисунке представлен пример анализа осаждения (pull-down assay) с использованием Cal Modlin для проверки связывания GFP-TAG Neuro Grandin по сравнению с эндогенным neuro Grandin. Гомогенный входной контроль показывает, что GFP neuro Grandin экспрессировался наряду с эндогенным neuro grandin и кальций-кальмодулин-зависимой киназой 2, что соответствует ожиданиям, основанным на известном связывании эндогенного neuro Grandin.

GFP-меченый Neuro Grandin элюировался в отсутствие кальция и не связывался в его присутствии. Напротив, контрольная кальций-кальмодулин-зависимая киназа 2 элюировалась только в присутствии кальция и оставалась несвязанной в его отсутствие. Это показывает, что калмодулин-бидсы функционировали правильно и EEU были эффективны.

Что наиболее важно, это показывает, что GFP-нейрогринин связывается с апохолокальмодулином аналогично эндогенной форме, что свидетельствует о том, что GFP-метка не изменила функцию рекомбинантного белка. После освоения данной техники, не включая SDS-PAGE и вестерн-блот-анализ, процедура может быть завершена за шесть часов при правильном выполнении. При выполнении этой процедуры важно не забывать маркировать все образцы и пробирки в соответствии с условиями, так как любое изменение концентрации кальция может поставить под угрозу весь эксперимент. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое понимание того, как эффективно определять способность конкретных белков связываться с кальмодулином кальций-зависимым образом.

Путем сбора интересующих белков, их инкубации с соответствующим образом подготовленным комодулянтом SRO, элюции связавшихся белков и их анализа с помощью вестерн-блоттинга.