Раскрывающееся кальмодулина-связывающие белки

Общей целью этой процедуры является тестирование белков, которые связываются с Cal Modlin кальций-зависимым образом. Это достигается путем предварительного сбора интересующих белков. Далее подготавливаются сероскорости кальмодулина для связывания белка.

Затем белки инкубируются с помощью сероскорости кальмодулина. Наконец, упоминаются белки, которые связываются кальций-зависимым образом. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают белки, которые связываются с кальмодулином в присутствии или отсутствии кальция с помощью западного анализа крови.

Основное преимущество этой методики перед другими существующими методами, такими как спокойная хроматография и иммунопреципитация, заключается в том, что она требует меньше белка и меньше времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области передачи сигналов коровьего модлина, например, какие белки связываются с коровьим модлином кальций-зависимым образом, и как посттрансляционные модификации могут повлиять на их связывание с коровьим модлином. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как шаги по работе с бусинами имеют важное значение, а описание реанимации и удержания бусин трудно проследить, не увидев его.

Для подготовки тканей к гомогенным введению органотипических срезов гиппокампа с вирусом, содержащим плазмиду, экспрессирующую представляющий интерес рекомбинантный белок. В этом примере рекомбинантным белком является GFP, помеченный как Neuro Grandin. Дайте ткани экспрессировать белок в течение ночи примерно через 12-18 часов после инъекции вируса, добавьте один миллилитр буфера для рассечения в чашку Петри.

Перенесите культивированную ткань со вкладышем в чашку Петри и добавьте два миллилитра буфера для рассечения во вкладыш, чтобы погрузить ткань с помощью скальпеля. Соберите от пяти до 10 органотипических срезов ткани гиппокампа, аккуратно соскребая ткань со вставленной мембраны с помощью перевернутой пастбищной пипетки. Перенесите подвешенную ткань в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Далее центрифугируйте образцы при 1500 RCF в течение одной минуты. Чтобы отделить ткань от диссекционного буфера, осторожно удалите надосадочную жидкость методом аспирации. Следите за тем, чтобы не потревожить гранулы.

Для каждого используемого среза добавьте салфетку в 30-60 микролитров гомогенизационного буфера с помощью пипетки объемом один миллилитр с отрезанным кончиком, а затем тщательно гомогенизируйте ее с помощью пестика, прежде чем вернуть гомогенат в исходную пробирку. Чтобы удалить клеточный мусор, остатки гомогената центрифугируются при 1100 RCF в течение 10 минут и осторожно собирают сор путем аспирации, избегая загрязнения от гранул. Аликвота 10% надосадочной жидкости в качестве образца входа.

Храните оставшуюся надосадочную жидкость на льду во время подготовки серобусин к использованию. Затем для каждой вытягивающей вниз пипетки 400 микролитров взвешенного кал Modlin Sero со скоростью в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку с относительно плоским дном для максимизации площади поверхности и взаимодействия растворов с шариками во время инкубации, вращают микроцентрифужную трубку на боку для смачивания шариков, а затем центрифугируют шарики при 21. 000. RCF на 30 секунд.

И аккуратно удалить надосадочную жидкость методом аспирации. Убедитесь, что вы не беспокоите бусины, чтобы промыть бусины на 100 микролитрах соответствующего гомогенизационного буфера, содержащего либо два миллимоляра хлорида кальция, либо в бусинах, используемых для удаления белков, связывающих кальций и модлин кальция. Или два миллимолярных E-D-T-A-A известного хелататора кальция к гранулам, используемым для снижения апокал-модлин-связывающих белков.

Аккуратно постучите трубкой по Резусу. Подвешивайте шарики и центрифугу при температуре 1500 RCF на одну минуту. Осторожно удалите надосадочную жидкость путем аспирации, следя за тем, чтобы не повредить шарики, чтобы связать белки со сферосферами кальмодулина для оттягивания.

Начните с разделения SNAT на два равных тома. В зависимости от состояния на аликвоту добавьте соответствующее количество хлорида кальция или ЭДТА в супернат до конечной концентрации в два миллимоля. Добавьте надосадочную жидкость к промытым шарикам в соответствующем гомогенизационном буфере.

Аккуратно постучите по трубке для перемешивания. Инкубируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех часов на шейкере. Мы подвешиваем бусины каждые 30 минут или около того, чтобы повысить эффективность связывания.

Затем центрифугируйте образцы при температуре 1500 RC F в течение трех минут. Удалите 50 микролитров надосадочной жидкости в качестве образца несвязанного белка и осторожно удалите оставшуюся жидкость путем аспирации и выбросьте. Промойте бусины три раза, как и раньше, 100 микролитрами соответствующего гомогенизационного буфера.

Самым сложным этапом в этой процедуре является эффективное элюциан целевых белков. Лучший способ обеспечить успех — использовать правильный тип трубки, чтобы свести к минимуму потери гранул и надлежащим образом ресуспендировать гранулы при нагревании буфера элюирования. Предварительный буфер для элюирования также может значительно помочь разбавить белок в 50 микролитрах элюцианского буфера до гранул.

Образцы, которые были гомогенизированы и связаны в буфере, содержащем кальций, упоминаются в буфере, содержащем ЭДТА, а образцы, в которых был буфер, содержащий ЭДТА, упоминаются кальцием. Выдержите бусины при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере. Перемешивайте шарики, осторожно постукивая по трубочке примерно каждые пять минут.

Центрифугируйте шарики при 1500 RCF в течение трех минут и осторожно удалите 50 микролитров SNAT для образца связанного белка путем аспирации. Следите за тем, чтобы не потревожить бусины. Проведите страничный SDS и вестерн-блоттинг для определения интересующего белка в качестве положительного контроля в противоположном состоянии.

Известно, что белок Prop Pro связывается с Cal Modlin. На этом рисунке показан пример анализа Cal Modlin, тестирующего связывание Cal MODLIN GFP TAG Neuro Grandin по сравнению с эндогенным нейро Grandin. Гомогенные данные показывают, что GFP neuro Grandin экспрессировался в дополнение к эндогенному нейрограндину и кальмодулин-зависимой киназе 2, как и ожидалось на основании известного связывания эндогенного нейро Grandin.

Меченный GFP Neuro Grandin упоминался в отсутствие кальция и не связывался в присутствии кальция. Напротив, контрольная кальмодулин-зависимая киназа 2 упоминалась только в присутствии кальция и не связывалась при его отсутствии. Это показывает, что гранулы кальмодулина функционировали должным образом, а ЕАЭС был эффективным.

Самое главное, это показывает, что GFP neuro grin связывается с Apoch Cal Modlin аналогично эндогенной форме, предполагая, что метка GFP не изменяет функцию рекомбинантного белка. После освоения этой техники, не включая SDS и западный анализ крови, может быть завершен за шесть часов при правильном выполнении При попытке выполнить эту процедуру важно не забывать маркировать все образцы и пробирки для соответствующего состояния, потому что любое изменение концентрации кальция может поставить под угрозу весь эксперимент. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как эффективно определять способность определенных белков связывать модуль CAL кальций-зависимым образом.

Собирая интересующие вас белки, инкубируя их с соответствующим образом подготовленным комодулантом SRO, ускользая от связанных белков и проверяя их с помощью западного анализа крови.