Иммуноокрашивание расчлененного данио рерио Эмбриональные сердца

Общая цель этой процедуры заключается в проведении иммуноокрашивания эмбриональных сердец рыбок данио-рерио для выявления клеточных или субклеточных структур в высоком разрешении. Это достигается путем предварительной подготовки предметных стекол во увлажненной камере для иммуноокрашивания. Затем сердце препарируется из обезболенного эмбриона данио-рерио, после чего на сердце эмбриона проводится иммуноокрашивание специфическим антителом.

Затем изображения сердец рыб документируются с помощью микроскопа, оснащенного аомом. Наконец, клеточные или субклеточные структуры в эмбриональном сердце рыбки данио выявляются с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии из-за значительно возросшей проникающей способности. Мужское преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как домашнее иммуноокрашивание, заключается в возможности получения высококачественных изображений стандартного сердца данио-рерио

Предотвратите высыхание образцов, положив стопку влажных бумажных полотенец на дно камеры, а поверх бумажных полотенец поместите небольшую микропластину в качестве стойки для слайдов. С помощью графического пера для лунок рисуют на поверхности предметного стекла микроскопа либо круги, либо линии размером примерно пять на пять миллиметров. Дайте горкам высохнуть.

Поставьте предметные стекла во увлажненную камеру и добавьте в каждую лунку по 50 микролитров формальдегида. Чтобы вскрыть сердце эмбриона, обезболите эмбрион рыбы в воде из трех яиц, содержащей 0,4% трики, до тех пор, пока рыба не прекратит все движения тела, но при этом сохранит нормальное сердцебиение. Около минуты.

Перенесите эмбрионы в вогнутую форму. Хорошо поместите вогнутое предметное стекло микроскопа на предметный столик для препарирующего микроскопа, используя либо темное поле, либо DIC, как поляризованный свет. Отрегулируйте свет микроскопа так, чтобы четко было видно сердце.

Затем очистите два инсулиновых шприца с 75% этанолом. Затем высушите, увеличьте увеличение микроскопа, чтобы сфокусироваться на сердце. Далее физически зафиксируйте зародыш, вставив один кончик иглы в желток, чтобы граница клеща была близко к голове.

Затем введите еще одну иглу близко к области сердца и быстро вытащите сердце. Если сердце не полностью отделено от эмбриона, отрежьте оставшуюся соединительную ткань между сердцем и желтком. Сосредоточьтесь на сердце при меньшем увеличении.

С помощью пипетки на 10 микролитров человек устанавливает объем в один микролитр. Приложите кончик пипетки, чтобы взять или коснуться образца сердца так, чтобы изолированное сердце оказалось либо внутри, либо прикреплено к поверхности наконечника пипетки. Опустите наконечник пипетки в раствор формальдегида на подготовленные предметные стекла и нажмите на поршень пипетки, чтобы выпустить сердце в раствор.

С сердечком в формальдегиде на углублении предметных стекол закрыть камеру и поместить ее на шейкер с легким покачиванием на 20 минут при комнатной температуре, вытереть воду с обратной стороны предметных стекол и поместить предметные стекла на столик диссекционного микроскопа для буферной подмены. С помощью пипетки объемом 10 микролитров осторожно отсасывайте формальдегид из предметного стекла, не беспокоя сердца. Добавьте 50 микролитров PBST, чтобы покрыть образцы сердца, и инкубируйте во увлажненной камере в течение пяти минут.

Ополосните сердечки второй раз в PBST. Затем заблокируйте образец сердца 10% овечьей сывороткой в PBST на один час при комнатной температуре. Затем инкубируйте образцы сердца с разведением от одного до 200 бета-катенина и двух специфических первичных антител F в 10% ПБСТ овечьей сыворотки в течение одного часа при комнатной температуре.

Промойте образцы сердца PBST три раза по пять минут каждый при комнатной температуре. Инкубируйте образцы с разведением 1:1000 метки Alexa, вторичных антител против музы и/или против кролика в PBST в течение 30 минут. Еще раз трижды промойте образцы PBST, чтобы получить изображение образцов.

Снимите PBST и добавьте в каждый по одному микролитру монтажной среды. Ну и покачиваем камеру в течение нескольких минут, пока раствор не станет прозрачным. Изображение сердца рыбы с помощью микроскопа Zes Axio план-два, оснащенного аомом На этом изображении ядра и клеточные мембраны кардиомиоцитов рыбы зебры из эмбриона рыбы данио через 52 часа после оплодотворения идентифицированы с антителами против MEF, двух С и бетаина соответственно.

Регулируя столик составного микроскопа, изображения образцов сердца могут быть настроены на одну и ту же ориентацию, что позволяет наблюдать внешнюю и внутреннюю кривизну сердца. Затем можно измерить общее количество кардиомиоцитов, размер клеток кардиомиоцитов и круговую форму Здесь показана саркомерная структура расчлененного эмбрионального сердца с использованием антитела к миозину F 59. Фиозная сеть Myo в желудочке всего эмбрионального сердца хорошо видна при меньшем увеличении, в то время как поперечно-полосатая полоса толстых нитей видна при большем увеличении.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить иммуноокрашивание рассеченного сердца рыбки эбро, особенно как препарировать сердце у рыбки данио-рерио апрель, и как обращаться с сердцем во время процесса иммуноокрашивания. Процесс.