Отслеживание Гипоксическая сигнализации в Encapsulated Агрегаты сотовый

Общая цель этой процедуры заключается в мониторинге клеточного ответа на гипоксию в инкапсулированных ПЭГ клеточных агрегатах. На первом этапе диспергированные клетки заражаются вирусом-маркером, а затем культивируются на шейкере, чтобы обеспечить образование агрегатов. Затем линейный колышек функционализируется и очищается рифморез PEG DM.

Затем клеточные агрегаты инкапсулируются в гидрогель PEG DM. Наконец, гидрогели культивируют в различных кислородных условиях, одновременно подвергаясь флуоресцентному мониторингу на предмет сигнала маркера гипоксии. В конечном счете, расположение и степень активности индуцируемого гипоксией фактора в жизнеспособных инкапсулированных агрегатах клеток могут быть визуализированы с помощью простой флуоресцентной микроскопии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инкапсуляции клеток и терапевтической доставки на основе клеток, такие как: Где возникает гипоксия в 3D-культурах и как она влияет на выживаемость и функционирование клеток? Применение этого метода распространяется на подходы регенеративной медицины и терапию дефицита гормонов, таких как сахарный диабет, из-за серьезного воздействия гипоксии на агрегированные и инкапсулированные ткани. Было показано, что активность индуцируемого гипоксией фактора один коррелирует со значительным снижением секреции инсулина бета-клетками, мотивируя попытки диссоциировать первичные глазки и преобразовать их в псевдоглазки.

Агрегаты уменьшенного диаметра. Наш маркер может указывать на активность индуцируемого гипоксией фактора с агрегатами на клеточном уровне в любом разрыхленном инкапсулирующем материале. ПЭГ был выбран в качестве материала капсулы из-за его благоприятных свойств переноса, совместимости с цито и легкости, с которой он может быть функционально модифицирован.

После взвесьте два грамма ПЭГ в стеклянный флакон объемом 40 миллилитров примерно 308 микролитров метамфетамина, акрила, ангидрида и неплотно закройте флакон твердой пластиковой крышкой. Разогрейте флакон на высокой мощности в течение двух минут в стандартной бытовой микроволновке. Затем, надев термостойкие перчатки, тщательно перемешайте флакон и разогрейте раствор в микроволновой печи на высокой мощности еще пять минут.

Ненадолго дайте флакону остыть настолько, чтобы его можно было держать, а затем откройте крышку, вращая флакон. Медленно смешайте метиленхлорид, перемешивая образец по мере необходимости, пока раствор не станет прозрачным и однородным. Затем добавьте раствор по каплям в 200 миллилитров перемешанного холодного датилового эфира, чтобы выпасть в осадок PEG dm.

Затем соберите PEG DM с помощью вакуумной фильтрации и дайте ему высохнуть. После того, как PEG DM высохнет, растворите его примерно в 100-150 миллилитрах деионизированной воды. Затем диализировать раствор против деионизированной воды в течение пяти дней в диализной трубке с отсечкой молекулярной массы 1000 Дальтон после диализа.

Разложите раствор по соответствующим емкостям и заморозьте их при температуре минус 80 градусов Цельсия на ночь. Затем лиофилизируйте раствор в течение четырех дней для получения очищенного белого порошка PEG DM для высвобождения клеток с поверхности обработанной культурной колбы. Сначала аспирируйте среду, промойте клетки кальцием с температурой 37 градусов CEL, HBSS, не содержащим магния, и аспирируйте HBSS.

Теперь добавьте два миллилитра 37 градусов Цельсия и раствор ЭДТА и дайте клеткам инкубироваться при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. Затем плотно прижмите боковую часть колбы, чтобы выбить клетки при температуре восемь миллилитров 37 градусов Цельсия, к колбе и энергично пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз. Следите за тем, чтобы не занести пузыри.

После переноса клеточного раствора в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, чтобы определить общее количество клеток, подлежащих заражению. Добавьте необходимый объем клеточной суспензии для достижения 400 000 клеток на лунку в лунки с шестилуночным культуральным планшетом, аликвоту 50 микролитров HBSS на лунку клеток, подлежащих заражению, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,8 миллилитров. Далее тщательно пипеткой наберите нужное количество вирусной суспензии в приготовленный HBSS.

Теперь добавьте соответствующий объем разведенного вируса в каждую лунку для достижения желаемого MOI, а затем добавьте среду в каждую лунку, чтобы довести общий объем до 1,7 миллилитров. Наконец, поместите планшет на орбитальный шейкер Внутри инкубатора установите шейкер на низкую настройку около 100 об/мин, чтобы среда мягко промывалась вокруг лунки и позволяла клеткам агрегироваться в течение 24-36 часов. Начните с того, что отрежьте конический кончик от пластикового шприца объемом в один миллилитр и поместите его открытым концом в стойку, чтобы создать сосуд, в котором будет формироваться гидрогель.

Затем нанесите пипеткой 20 микролитров фотоактивного раствора PEG DM в открытый конец шприца на поршень, убедившись, что объем покрывает всю поверхность поршня. Регулируйте поршень с небольшим шагом, чтобы получить плоскую поверхность жидкости. Теперь поместите пипетку обратно в штатив и расположите штатив под ультрафиолетовой лампой примерно на восемь минут, чтобы обеспечить гидрогелевую сшивку.

За это время объем пипетки, содержащей нужное количество ячеек и агрегатов, помещается в микроцентрифужную пробирку объемом 1,8 миллилитров. Закройте пробирку крышкой, а затем центрифугируйте клетки и агрегаты в течение пяти минут при 130 g. Затем с помощью микропипеттера осторожно удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу на кончике трубки.

По мере приближения головки фильтрующего материала к грануле используйте более тонкий наконечник для дозатора объемом 10 микролитров, равномерно распределяя клеточные агрегаты по всему раствору прекурсора геля, обеспечивая при этом их полную инкапсуляцию. Это самая сложная часть этой процедуры. При выполнении этого шага позаботьтесь о том, чтобы отшлифовать и аккуратно перенести гранулу.

Теперь аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 20 микролитрах фотоактивного раствора PEG DM. С помощью наконечника пипетки с широким горлышком и добавьте клеточную суспензию в шприц поверх сшитой гидрогелевой части, подвергните шприц дополнительному воздействию ультрафиолетового света в течение восьми минут, чтобы завершить построение гидрогеля. По завершении клетки должны быть полностью инкапсулированы в цилиндрический гидрогель.

Наконец, добавьте один миллилитр HBSS в одну лунку 24-луночного планшета и один миллилитр среды в другую. Ну а затем вытолкните гидрогель из шприца в HBSS, чтобы быстро смыть гель. Перенесите гель в среду и заквашивайте пластину в нужных условиях.

В любой момент культивирования клетки могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии для отслеживания инициации гипоксического сигнального места, 24-луночного планшета на предметном столике микроскопа, центрируя лунку с гидрогелем под объективом. Сигнал достаточно специфичен для идентификации отдельных сигнальных клеток, но разрешение может быть недостаточным для определения локализации внутриклеточного сигнала. В сигнальных клетках сигнал обычно наблюдается равномерно по всей цитоплазме.

На этом рисунке показан репрезентативный пример агрегатов minx, инкапсулированных в гидрогель ПЭГ внутри гелевой ячейки. Агрегаты должны быть полностью заключены в матрицу и равномерно распределены, чтобы обеспечить лучший транспорт питательных веществ, как показано здесь. Обратите внимание, как сшитый гель является твердым на всем протяжении, принимая форму сосуда, в котором проводилась реакция.

На этом рисунке показана репрезентативная сигнализация флуоресцентной гипоксии в агрегированных минимум шести клетках в гидрогеле PEG DM, клетки, которые были инкапсулированы, а затем помещены в инкубацию при 20% кислорода на 44 часа. На фото слева не проявляются сигналы гипоксии, в то время как клетки, которые были инкапсулированы, затем инкубировались в 2% кислорода в течение 44 часов. Как показано на рисунке справа, четкая повсеместная гипоксия сигнала также может отслеживаться в других типах клеток.

На этом рисунке показана репрезентативная гипоксическая сигнализация в инкапсулированных агрегатах мезенхимальных стволовых клеток. Как видно на крайнем левом рисунке, флуоресцентный сигнал не обнаруживается через 12 часов при 2% кислорода, затем, как видно на центральном рисунке, более заметен через 24 часа при 2% кислорода. И, наконец, как видно справа, высокая экспрессия через 96 часов и 2% кислорода после этой процедуры.

Другие методы, такие как Элиза, анализ секретируемых белков и анализы жизнеспособности клеток, могут быть выполнены для того, чтобы коррелировать гипоксическую передачу сигналов с фенотипом клетки. Благодаря этой разработке, этот метод может проложить путь исследователям в области тканевой инженерии и клеточной терапевтической доставки для изучения функции выживания и дифференцировки клеток в каркасах и материалах инкапсуляции.