Отслеживание Гипоксическая сигнализации в Encapsulated Агрегаты сотовый

Общая цель данной процедуры — мониторинг клеточного ответа на гипоксию в клеточных агрегатах, инкапсулированных в PEG. На первом этапе диспергированные клетки инфицируют маркерным вирусом, после чего их культивируют на шейкере для формирования агрегатов. Затем проводят функционализацию линейного PEG и очистку PEG DM праймера.

Затем агрегаты клеток инкапсулируют в гидрогель PEG DM. В завершение гидрогели культивируют в различных условиях содержания кислорода, осуществляя флуоресцентный мониторинг сигнала маркера гипоксии. В итоге с помощью простой флуоресцентной микроскопии можно визуализировать локализацию и степень активности фактора, индуцируемого гипоксией, внутри жизнеспособных инкапсулированных клеточных агрегатов.

Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в областях инкапсуляции клеток и доставки терапевтических клеточных препаратов, такие как: где именно возникает гипоксия в 3D-культурах и как она влияет на выживаемость и функции клеток? Значимость данной методики распространяется на подходы регенеративной медицины и терапию гормональной недостаточности, например, при сахарном диабете, ввиду существенного влияния гипоксии на агрегированные и инкапсулированные ткани. Было показано, что активность фактора, индуцируемого гипоксией 1, коррелирует со значительным снижением секреции инсулина бета-клетками, что стимулирует попытки диссоциировать первичные островки и реформировать их в псевдоостровки.

Агрегаты уменьшенного диаметра. Наш маркер позволяет определить активность фактора, индуцируемого гипоксией, в агрегатах на клеточном уровне внутри любого разрыхленного инкапсулирующего материала. В качестве материала капсулы был выбран ПЭГ благодаря его благоприятным транспортным свойствам, цитосовместимости и простоте функциональной модификации.

В стеклянный флакон объемом 40 мл отвешивают два грамма PEG, добавляют примерно 308 мкл метакрилового ангидрида и неплотно закрывают флакон жесткой пластиковой крышкой. Помещают флакон в бытовой микроволновый печь и подвергают воздействию СВЧ-излучения на высокой мощности в течение двух минут. Затем, используя термостойкие перчатки, тщательно перемешивают содержимое флакона на вортексе и повторно подвергают раствор воздействию СВЧ-излучения на высокой мощности в течение еще пяти минут.

Дайте флакону немного остыть, чтобы его можно было взять в руки, затем снимите крышку, осторожно вращая флакон. Медленно прилейте метиленхлорид, при необходимости перемешивая образец на вортексе до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и гомогенным. Затем по каплям добавьте раствор в 200 milliliters перемешиваемого холодного диэтилового эфира для осаждения PEG dm.

Затем соберите PEG DM путем вакуумной фильтрации и дайте ему высохнуть. После высыхания PEG DM растворите его примерно в 100–150 миллилитрах деионизированной воды. Затем диализируйте раствор против деионизированной воды в течение пяти дней, используя диализную трубку с пределом отсечения по молекулярной массе 1000 Дальтон.

Разлейте раствор в подходящие контейнеры и заморозьте их при температуре -80 °C на ночь. Затем лиофилизируйте раствор в течение четырех дней для получения очищенного белого порошка PEG DM, который будет использоваться для отделения клеток от поверхности обработанной культуральной колбы. Сначала аспирируйте среду, промойте клетки HBSS без кальция и магния при 37 °C и аспирируйте HBSS.

Теперь добавьте два миллилитра раствора tryps и EDTA, подогретого до 37 °C, и инкубируйте клетки при 37 °C в течение трех минут. Затем с силой постучите по стенке флакона, чтобы высвободить клетки, добавьте во флакон восемь миллилитров среды при 37 °C и энергично перемешайте клеточную суспензию, многократно пропуская ее через пипетку, стараясь не допустить образования пузырьков.

После переноса клеточного раствора в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра, чтобы определить общее число клеток для инфицирования. Добавьте в лунки шестилуночного планшета для суспензионного культивирования необходимый объем клеточной суспензии, чтобы получить 400 000 клеток на лунку; затем в микроцентрифужную пробирку объемом 1,8 мл внесите аликвоту HBSS объемом 50 µL на каждую лунку с клетками, предназначенными для инфицирования. После этого осторожно пипеткой добавьте соответствующий объем вирусной суспензии в подготовленный HBSS.

Теперь добавьте в каждую лунку соответствующий объем разведенного вируса для достижения желаемого MOI, а затем долейте среду до общего объема 1.7 milliliters. В завершение поместите планшет на орбитальный шейкер внутри инкубатора, установите низкую скорость вращения шейкера — около 100 RPM, чтобы среда осторожно омывала лунку, и оставьте клетки для агрегации на 24–36 часов. Начните с того, что отсеките конусообразный наконечник у пластикового шприца объемом one milliliter и поместите его открытым концом вверх в штатив, чтобы создать емкость, в которой будет формироваться гидрогель.

Затем с помощью пипетки нанесите 20 µL раствора фотоактивного PEG DM в открытый конец шприца на поршень, убедившись, что объем жидкости полностью покрывает поверхность поршня. Незначительно перемещайте поршень, чтобы добиться плоской поверхности жидкости. Теперь верните пипетку в штатив и поместите штатив под УФ-лампу примерно на восемь минут для сшивания гидрогеля.

В течение этого времени перенесите пипеткой объем, содержащий нужное количество клеток и агрегатов, в микроцентрифужную пробирку объемом 1,8 мл. Закройте пробирку крышкой и центрифугируйте клетки и агрегаты в течение пяти минут при 130 ×g. Затем с помощью микропипетки осторожно удалите супернатант, не затрагивая осадок клеток на дне пробирки.

Когда наконечник доходит до осадка, используйте более тонкий наконечник дозатора на 10 µL. Равномерно распределите клеточные агрегаты по всему объему раствора-предшественника геля, обеспечивая их полную инкапсуляцию. Это самый сложный этап данной процедуры. При выполнении этого шага будьте осторожны, чтобы аккуратно ресуспендировать и перенести осадок.

Теперь аккуратно ресуспендируйте осадок клеток в 20 µL фотоактивного раствора PEG DM. С помощью наконечника для пипетки с широким отверстием перенесите клеточную суспензию в шприц поверх сшитой части гидрогеля, затем подвергните шприц дополнительному воздействию УФ-излучения в течение восьми минут для завершения формирования гидрогеля. По окончании процедуры клетки должны быть полностью инкапсулированы внутри цилиндрического гидрогеля.

Наконец, добавьте 1 mL HBSS в одну лунку 24-луночного планшета и 1 mL среды в другую. Затем выдавите гидрогель из шприца в HBSS для короткой промывки геля. Перенесите гель в среду и культивируйте планшет в необходимых условиях.

На любом этапе культивирования клетки можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы отследить начало гипоксического сигналинга; для этого поместите 24-луночный планшет на предметный столик микроскопа, центрируя лунку с гидрогелем под объективом. Сигнал достаточно специфичен для идентификации отдельных сигнализирующих клеток, однако разрешения может быть недостаточно для определения внутриклеточной локализации сигнала. В сигнализирующих клетках сигнал обычно наблюдается равномерно по всей цитоплазме.

На этом рисунке представлен типичный пример агрегатов minx, инкапсулированных в ПЭГ-гидрогель внутри гель-клетки. Для обеспечения лучшего транспорта питательных веществ агрегаты должны быть полностью заключены в матрикс и распределены гомогенно, как показано здесь. Обратите внимание, что сшитый гель остается плотным по всему объему, принимая форму сосуда, в котором проводилась реакция.

На данном рисунке показана репрезентативная флуоресцентная сигнализация гипоксии в агрегатах клеток min six в гидрогеле PEG DM; клетки были инкапсулированы, а затем помещены в инкубатор при 20% oxygen на 44 часа. На снимке слева сигнализация гипоксии отсутствует, в то время как клетки, которые были инкапсулированы, а затем инкубированы при 2% oxygen в течение 44 часов, как показано на снимке справа, демонстрируют отчетливый повсеместный сигнал. Гипоксию также можно отслеживать в других типах клеток.

На этом рисунке представлена репрезентативная гипоксическая сигнализация в инкапсулированных агрегатах мезенхимальных стволовых клеток. Как видно на крайнем левом рисунке, через 12 часов при 2% oxygen флуоресцентный сигнал не обнаруживается; затем, как показано на центральном рисунке, он становится более выраженным через 24 hours при 2% oxygen. И, наконец, как видно на правом рисунке, после применения данной процедуры наблюдается высокая экспрессия через 96 hours при 2% oxygen.

Для корреляции гипоксического сигналинга с фенотипом клеток можно использовать другие методы, такие как ELISA, анализ секретируемых белков и тесты на жизнеспособность клеток. Благодаря развитию данной методики исследователи в области тканевой инженерии и клеточной терапии смогут изучать функции выживания и дифференцировку клеток внутри скаффолдов и инкапсулирующих материалов.