Моделирование и обработка изображений 3-мерная коллективной Вторжение сотовый

Данная экспериментальная система предназначена для характеристики вклада специфических белков в процесс инвазии. Начните с ретровирусной трансдукции клеток интересующим флуоресцентным белком. Также создайте 3D-матрикс из белка Matrigel в инсертах Transwell и приготовьте клеточную суспензию с соответствующим разведением.

С помощью системы Transwell с Matrigel измерьте ответ трансмиграции на хемоаттрактант при воздействии исследуемых препаратов или методов лечения, затем перейдите к визуализации и анализу инвазии клеток с помощью конфокальной микроскопии. В конечном итоге полученные результаты позволяют определить степень и характер инвазии клеток в трехмерный белковый матрикс. Преимущество данного метода перед существующими подходами, такими как традиционный анализ инвазии в системе Transwell, заключается в возможности получения как количественных, так и качественных данных об инвазии клеток в трехмерный белковый матрикс.

Моя коллега, Дайан Крейтон, продемонстрирует метод культивирования клеток для упаковки ретровирусов в среде DMEM с 10% FBS в течение 48 часов. Проведите трансфекцию клеток ретровирусной ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Инкубируйте в течение 24 часов, дважды промойте лунки средой, затем добавьте в каждую лунку 1,5 мл 10% FBS-DMEM и инкубируйте в течение 48 часов для сбора упакованного ретровируса.

Перенесите среду для культивирования тканей в микроцентрифужные пробирки объемом два миллилитра, центрифугируйте для осаждения всех клеток и соберите супернатант в чистую пробирку. Храните этот сток ретровируса при температуре минус 80 °C. Для ретротрансдукции клеток удалите среду из культуры после ночного инкубирования и добавьте один миллилитр стока ретровируса с добавлением poly green.

После шестичасовой инкубации добавьте в лунку 2 mL 10%F-B-S-D-M-E-M и поместите планшеты в инкубатор при 37 °C. В течение ночи обновите среду, а через 24 часа добавьте соответствующую селективную среду; после достижения конфлюэнтности соберите клетки и проведите сортировку по флуоресценции, используя нетрансдуцированные клетки в качестве контроля. Соберите клетки с уровнем флуоресценции выше, чем у нетрансдуцированных клеток, и заморозьте аликвоты при -80 °C для дальнейшего использования.

Этот метод основан на экспрессии флуоресцентных белков для визуализации и позволяет определить вклад отдельных клеток. Разогрейте Matrigel на льду, затем разведите его в соотношении один к одному в ледяном PBS. Поместите непокрытые трансвелл-вставки в 24-луночный планшет для культивирования тканей.

Затем аккуратно перенесите пипеткой 100 µL разведенного матригеля в лунки и дайте ему затвердеть при 37 °C. Тем временем подготовьте суспензии флуоресцентно меченных клеток в соответствующей ростовой среде. После затвердевания матригеля переверните трансвеллы и внесите пипеткой 100 µL клеточной суспензии на нижнюю сторону фильтра, обращенную к выходу.

Осторожно накройте трансвеллы дном 24-луночного планшета для культивирования тканей так, чтобы основание планшета касалось каждой капли клеточной суспензии. Инкубируйте планшет в перевернутом состоянии в течение четырех часов для обеспечения прикрепления клеток. Затем переверните планшет в правильное положение и промойте каждый трансвелл, дважды погружая его в один миллилитр безсывороточной среды.

Затем поместите трансвелл в третью лунку, содержащую любые препараты или реагенты для обработки. Осторожно внесите пипеткой 100 µL среды с хемоаттрактантом в трансвелл поверх затвердевшей смеси Matrigel и PBS. Инкубируйте от трех до пяти дней при 37 °C с 5% CO2 для визуализации нефлуоресцентных клеток, инвазировавших в Matrigel.

Поместите трансвеллы в новые 24-луночные планшеты и пипеткой нанесите 1 mL 4 µM раствора Calcein AM на каждый plug из Matrigel, позволяя раствору стекать по краям для окрашивания как сверху, так и снизу. Инкубируйте в течение одного часа при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. Затем проведите визуализацию с помощью конфокальной микроскопии.

Данный первый метод окрашивания живых клеток позволяет визуализировать способы инвазии. Перенесите каждый трансвелл на новую планшетку с 24 лунками, добавьте один миллилитр 4% параформальдегида и 0,2% Triton X 100, затем инкубируйте при комнатной температуре в течение получаса. После трехкратной промывки одним миллилитром PBS добавьте RNase A в концентрации 0,01 мг/мл на 30 минут, затем промойте дважды PBS перед визуализацией.

Пропидий йодид разводят в PBS и выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Промывают трижды с использованием PBS. На этом этапе трансвеллы, окрашенные пропидий йодидом, можно хранить при комнатной температуре в темноте не менее одного месяца.

Второй метод окрашивания клеток требует фиксации, но позволяет более быстро количественно оценить инвазию. Используя инвертированный конфокальный микроскоп, поместите трансвелл с небольшим количеством остаточного PBS на большой покровное стекло, используя объектив с увеличением 20-кратным без иммерсии, и зарегистрируйте оптические срезы через каждые 10–15 мкм от основания пробки из Matrigel. Количественно оцените степень инвазии, используя отдельные оптические срезы. Также создайте трехмерные объекты с помощью соответствующего программного обеспечения, такого как Velocity, на основе данной серии оптических срезов; клетки были окрашены Calcium AM.

Как и ожидалось, количество клеток, мигрирующих вверх через фильтр, уменьшается по мере увеличения расстояния. Эту инвазию можно количественно оценить. Трехмерные реконструкции клеточной инвазии позволяют наглядно представить характер этого процесса.

Если клетки помечены экспрессией флуоресцентных белков, то положение клеток каждого цвета можно визуализировать на трехмерных реконструкциях, как показано на данном виде сбоку. Кроме того, срезы через реконструкцию позволяют получить представление о молекулярных механизмах. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как использовать этот анализ инвазии клеток для получения более подробной информации о процессе инвазии, чем это возможно при использовании стандартных методов.