Скелетных мышц Гендерный диморфизм от протеомики

Общая цель данной процедуры заключается в определении гендерной специфичности различий в протеомных профилях скелетных мышц. Для этого сначала проводят измельчение и тщательную гомогенизацию тканей двуглавой мышцы плеча самцов и самок мышей с целью экстракции большинства белков. Затем образец наносят на полоску геля для изоэлектрического фокусирования (IEF), где белки разделяются по их изоэлектрической точке, после чего проводят электрофорез в ПААГ с SDS (SDS-PAGE) для разделения во втором измерении по размеру. После окрашивания и визуализации гелей сравнивают протеомные профили образцов мышц самцов и самок, а затем вырезают пятна со значительными различиями в содержании между двумя полами.

В завершение белки в гелевых пробках подвергают трипсинолизу. Полученные пептиды экстрагируют из геля и анализируют с помощью нано-жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии для их идентификации. В конечном итоге, с помощью двумерного электрофореза в геле и протеомики на основе масс-спектрометрии можно получить результаты, демонстрирующие дифференциальную экспрессию белков в двух или более экспериментальных условиях.

Хотя данный метод позволяет изучить гендерную специфику мышц, его также можно применять к другим клеткам, тканям, органам или жидкостям в различных физиологических состояниях. Процедуру продемонстрирует доктор Калина Дива, технический директор Центра протеомики Смит-колледжа. После изоляции, очистки и измельчения скелетных мышц мыши при использовании 45 µL экстракционного буфера на грамм ткани (рецепты этого и всех остальных буферов приведены в письменном протоколе), гомогенизируйте ткань с помощью моторизованного пестика семь раз по 15 секунд при температуре 4 °C, обеспечивая двухминутное охлаждение на льду между каждой гомогенизацией.

Центрифугируйте образцы при 15,800 Gs в течение 30 минут при температуре четырех градусов Цельсия. Соберите супернатант и измерьте его объем. Удалите осадок, чтобы осадить белки в трех объемах льда.

Холодный ацетон квалификации «чистый для анализа» в объеме, равном объему супернатанта. Перемешайте содержимое пробирок на вортексе в течение 15 секунд, затем центрифугируйте при 15 800 G в течение 10 секунд для получения осадка. Удалите супернатант, ресуспендируйте осадок в буфере для экстракции с помощью моторизованного пестика и полипропиленовых стержней для перемешивания, после чего проведите повторное осаждение белков, добавив еще три объема ацетона.

После ресуспендирования осадка в буфере для экстракции определите концентрацию белка и/или сохраните образцы при температуре -20 °C. Для проведения изоэлектрического фокусирования белков изморозьте готовую полоску IPG из морозильной камеры (-20 °C) и дайте ей уравновеситься при комнатной температуре в течение 10–15 минут. Перемешайте образец на вортексе и нанесите пипеткой от 600 до 800 µg белка прямой линией вдоль заднего края канала в кювете для регидратации образцов, оставляя примерно по одному сантиметру с каждого конца.

С помощью пинцета снимите пластиковую защитную пленку с полоски IPG, стараясь держать полоску только за концы и избегая любого контакта с гелем. Определите конец полоски с пометкой «плюс» и расположите его с левой стороны кюветы. Поместите полоску IPG гелевой стороной вниз поверх образца.

Следите за тем, чтобы под полоской не оставалось пузырьков воздуха. Оставьте ее для регидратации на один час. Покройте полоску 2.5 milliliters минерального масла.

Накройте кювету крышкой и оставьте для регидратации на ночь. На следующий день при комнатной температуре поместите бумажный фитиль по обоим концам фокусирующего канала кюветы и смочите каждый из них 10 µL воды Millipore. Извлеките полоску IPG и удерживайте ее в вертикальном положении около 10 секунд.

Чтобы удалить излишки масла, промокните пластиковую подложку салфеткой Kim wipe. Поместите полоску IPG гелевой стороной вниз, расположив basic-конец слева. В фокусирующем лотке залейте полоску 2.5 milliliters минерального масла.

Поместите кювету в камеру для изоэлектрического фокусирования (IEF) Protean и запрограммируйте трехэтапный протокол при температуре в камере по умолчанию 20 °C, максимальной силе тока 50 µA на полоску и без времени регидратации. После завершения программы перенесите полоску геля стороной с сайтом вверх в кювету для эквилибрации длиной 11 см. Добавьте 4 мл восстанавливающего буфера в канал и проведите эквилибрацию полоски в течение 10 минут при легком встряхивании.

Удалите восстанавливающий буфер, добавьте в канал четыре миллилитра алкилирующего буфера и уравновесьте полоску, перемешивая ее в течение еще 10 минут. Промойте IPG-полоску, кратковременно погрузив ее в 1X SDS-буфер для электрофореза. Затем положите полоску гелевой стороной вверх на заднюю пластину 11-сантиметровой системы Criterion.

Заранее приготовьте полиакриламидный гель с 10,5–14% Tris-HCl-SDS и осторожно прижмите его так, чтобы он полностью соприкасался с SDS-гелем. Убедитесь, что между поверхностями двух гелей не осталось пузырьков воздуха. Покройте полоску IPG одним миллилитром расплавленного раствора агарозы и дайте ему затвердеть в течение пяти минут.

Затем внесите 5 µL маркера белков в отдельную лунку. Проведите электрофорез геля в SDS-буфере при напряжении 200 В при комнатной температуре или при 4 °C. Когда фронт красителя достигнет нижней части геля, извлеките его из пластиковой формы и окрашивайте в течение ночи, осторожно встряхивая в растворе Кумасси бриллиантового синего.

Промойте гель в растворе для обесцвечивания 1 дважды по три часа, а затем в растворе для обесцвечивания 2 в течение ночи. Храните гель в 7% acetic acid для последующего анализа. После получения изображений геля проведите сравнительный анализ паттернов пятен между гелями и вырежьте интересующие пятна; добавьте 200 µL раствора для обесцвечивания к фрагментам геля, перемешайте на вортексе и инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 минут при перемешивании.

Затем осторожно удалите и утилизируйте раствор, после чего повторите процедуру. Добавьте 30 µL свежеприготовленного восстанавливающего буфера в пробирки с фрагментами геля и инкубируйте при 60 °C в течение 10 минут. Дайте образцам остыть.

Затем удалите и утилизируйте буфер. Добавьте 30 µL алкилирующего буфера и инкубируйте образцы в темноте при комнатной температуре в течение одного часа, после чего удалите и утилизируйте алкилирующий буфер. Промойте гелевые пробки, добавив по 200 µL обесцвечивающего раствора в каждую пробирку, и инкубируйте образцы при 37 °C в течение 15 минут.

Удалите и утилизируйте раствор для детенирования и повторите промывку. Затем добавьте 50 microliters ацетонитрила к гель-пробкам и инкубируйте их в течение 10 минут при комнатной температуре для их высушивания путем сжатия. После этого осторожно удалите ацетонитрил и повторите процедуру с фрагментами геля.

Фрагменты должны выглядеть белыми и маленькими. Поместите кусочки геля в концентратор для высушивания на 10 минут. Набухните фрагменты геля, добавив 10 µL раствора активированного трипсина.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте в пробирки 25 µL буфера для переваривания. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение ночи с перемешиванием, затем обработайте образцы ультразвуком в течение 10 минут и центрифугируйте их перед переносом супернатанта в новую пробирку.

Для дальнейшей экстракции пептидов добавьте 10 µL 0,1% муравьиной кислоты в пробки и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре с встряхиванием, затем подвергните образцы соникации в течение 10 минут. Соберите супернатант и объедините его с ранее сохраненным супернатантом. Затем белки можно обессолить и подготовить для масс-спектрометрии в сочетании с ВЭЖХ. Была проведена экстракция скелетных мышц спины нетренированных самцов и самок с последующим разделением в виде двумерной карты.

На первом уровне сравнительного протеома мышц после визуализации с помощью цифровой обработки изображений высокого разрешения в каждом образце было обнаружено около 800 белковых пятен, как показано здесь. При использовании карты протеома самцов в качестве базовой линии становится очевидным, что многие пятна изменяют свою интенсивность в протеоме самок: пятна, интенсивность которых у самок увеличилась в два раза и более, обведены красным, а те, интенсивность которых снизилась в два раза и более, — синим. Идентификация белковых пятен, интенсивность которых изменилась более чем в два раза (в сторону увеличения или уменьшения) и что является статистически значимым при N=5 мышей, определяется путем анализа аминокислотной последовательности с использованием жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией.

На данном графике ось X представляет самок мышей до физической нагрузки, а ось Y — группу с одной единицей нагрузки в контрольной точке «ноль часов». Результаты показывают, что у самок наблюдается значительное снижение показателей энергетического метаболизма сахаров, активности ферментов, а также изоформ фермента креатинкиназы, отвечающих за иную систему энергоснабжения мышц. Как у людей, так и у животных уровни CK в сыворотке крови в состоянии покоя и после физической нагрузки выше у самцов, однако уровни CK в сыворотке не обязательно коррелируют с количеством миофибрилл.

Этот половой диморфизм в клеточном содержании CK в мышце biceps brachii у мышей является новым открытием и может объяснить физиологические различия в уровнях CK в сыворотке крови. После данной процедуры можно применить другие методы, такие как количественный иммуноблоттинг, для подтверждения полученных результатов. После просмотра этого видео у нас должно сложиться четкое представление о том, как подготавливать и разделять образцы для дифференциального профилирования протеома.