Крупномасштабные Запись нейронов Зонды Движимое кремния в Поведение грызунов

Привет, Шейн! Говорит Монти из лаборатории Биджи. Сегодня я покажу вам, как использовать кремниевые зонды для проведения высокоплотной электрофизиологической регистрации активности отдельных нейронов и локального полевого потенциала у бодрствующей крысы в условиях свободного поведения. Я продемонстрирую, как изготовить миниатюрный микропривод, закрепить на нем кремниевый зонд, а затем имплантировать зонд в мозг для проведения хронических записей.

Этот процесс довольно прост, но включает в себя ряд этапов. Итак, приступим. Перед вами небольшая коллекция микродисков для крыс и мышей, предназначенных для перемещения нескольких одиночных электродов, тетродов и кремниевых зондов, которые мы разработали и изготовили за последние годы.

Кремниевые зонды могут быть прикреплены к жестким печатным платам или гибким полиамидным кабелям. Здесь мы покажем, как закрепить этот четырехшанктовый зонд на микроприводе. Для подготовки привода нам понадобятся латунная пластина, сверла диаметром 55 и 65, метчик, однорядный штыревой разъем, винт 0 0 90 с соответствующей гайкой, держатель для сверл и отвертка.

Первым шагом является отделение трехконтактного фрагмента от соединительной планки. Осторожно извлеките средний контакт и расширьте отверстие, просверлив его сверлом размера 65. Затем нарежьте резьбу с помощью метчика.

Вырежьте два фрагмента из латунной пластины. Обработайте края пластин с помощью дремеля, затем просверлите в центре обоих фрагментов отверстия сверлом размера 55. Временно соберите привод так, чтобы латунные пластины касались штифтов; аккуратно затяните винты до достижения устойчивости конструкции.

Концы штифтов выводят наружу, затем припаивают к латунным пластинам. Микропривод почти готов. Выступающий конец винта опиливают напильником и припаивают к нему. Теперь у нас есть 2 сверхлегких микропривода.

Поворот по часовой стрелке приподнимет пластиковый мостик. Кремниевый зонд может быть прикреплен к приводу с помощью двух компонентов. Вес эластомера защитного шелкового слоя.

Смешайте компоненты в соотношении 10:1. С помощью заостренного ватного аппликатора нанесите этот защитный слой на верхний конец зонда. Дайте ему высохнуть в предварительно разогретом до 60 °C oven в течение не менее двух часов.

Для того чтобы участки записи были очищены от любого мусора, необходимо промыть наконечники. Приготовьте четырехкратный развод детергента Contra. Замочите зонд в детергенте при температуре 63 °C минимум на два часа.

Перед закреплением зонда в приводе необходимо смыть моющее средство, многократно погружая зонд в дистиллированную воду. Импеданс каждого участка записи следует проверить с помощью лезвия бритвы. С помощью двух микроманипуляторов сделайте несколько борозд на мостике, чтобы создать шероховатую поверхность.

Зонд располагают напротив мостика привода. Затем, перед началом операции, зонд фиксируют к мостику с помощью специального клея (grip cement). Подготавливают опорные и заземляющие электроды.

Залудите один конец изолированного медного провода примерно на один миллиметр. С помощью иглы зачистите головку винта из нержавеющей стали 0 0 90 и припаяйте к ней медный провод. Тщательно следите за тем, чтобы припой не попал в паз винта.

Вырежьте трапециевидные фрагменты из медной сетки. Эти фрагменты будут собраны для защиты головки усилителя. Хирургический инструментарий и подготовка такие же, как и при многих операциях на мелких животных.

Обратите внимание, что операция, показанная в данном видео, приведена исключительно в демонстрационных целях, для обеспечения надлежащей видимости и качества съемки. Ряд подготовительных этапов, мер предосторожности при проведении операции и послеоперационных процедур здесь не показаны. Пожалуйста, обратитесь к соответствующим руководствам по проведению хирургических операций на грызунах.

Вся операция проводится под газовой анестезией в условиях септического режима. После разреза кожи по срединной линии кожа и надкостница удаляются, череп очищают и просушивают. Измеряют положение и расстояние между брегмой и лямбдой, чтобы определить и отметить координаты X и Y места введения перед вскрытием черепа.

Для имплантации зонда несколько винтов вкручивают наполовину в кость; отверстия под электроды подготавливают как сверху, так и сбоку от них. Использование нескольких винтов критически важно для надежного закрепления головного блока на черепе при длительных хронических экспериментах. С помощью маленькой кисточки нанесите активатор Meta-Dentin на всю поверхность черепа.

Затем промойте его физиологическим раствором. Далее осторожно нанесите слой стоматологического цемента, покрывая ряд цепочек. Затем четыре медных клапана закрепляют на этом черепе с помощью цемента.

Теперь мы перешли к самому критическому этапу операции. Подготовке места имплантации зонда с помощью сверла с полусферическим наконечником. Сверление проводится в несколько этапов, при этом кость часто орошают физиологическим раствором.

Костный лоскут осторожно удаляют, а поверхность промывают для удаления остатков тканей. Необходимы два инструмента: крючок, изготовленный из иглы насекомого, и острые лезвия скальпеля для приподнятия и разрезания лоскута. Небольшое кровотечение купируют промыванием физиологическим раствором.

При возникновении сильного кровотечения или любом повреждении неокортекса следует рассмотреть возможность прекращения операции и подготовки другого животного. Теперь мы имплантируем кремниевый зонд. Зонд следует вводить в область, свободную от сосудов, используя при необходимости коагуляцию для остановки незначительных кровотечений.

Зонд помещают примерно на один миллиметр выше намеченной цели. Отверстие закрывают, нанося теплую расплавленную смесь парафина и минерального масла. Основание привода фиксируют в черепе коры с помощью цемента для крепления.

Соединительная часть зонда аналогично фиксируется к черепу. Заключительным и критически важным этапом операции является формирование из медной сетки защитного цилиндра вокруг зонда и привода. Цилиндр также служит электрическим экраном для защиты от внешних помех и медленноволновых артефактов, возникающих из-за электрического заряда вибриссов.

При использовании на живом животном высоту можно отрегулировать, срезав излишки материала. Провода от референтного электрода и заземления припаиваются к соответствующим контактам разъема. Заземление также припаивается к медной сетке.

Медные створки крепятся пайкой и усиливаются цементом. Движение приводного винта проверяют повторно в конце операции, закрепив верхнюю часть головного модуля кусочком латексной перчатки после надлежащего послеоперационного ухода. Животное в здоровом состоянии и ведет себя спокойно на следующий день.

Для обеспечения свободного перемещения животного мы рекомендуем использовать сверхлегкий и сверхгибкий многожильный провод. Тонкий кабель требует минимальной противовесной балансировки и не ограничивает движения. Качество записи проверяется ежедневно в домашней клетке.

Положение места регистрации оценивается как по паттернам спайков отдельных нейронов, так и по форме локальных полевых потенциалов. В нашем видео показана имплантация одного силиконового зонда, однако после определенной практики можно легко осуществлять многоканальную запись с использованием нескольких зондов и приводов. Мы также используем аналогичные, но меньшего размера приводы для имплантации силиконовых зондов в мозг мыши.

Наконец, регистрация сигналов с кремниевых зондов может быть эффективно совмещена с локальной световой стимуляцией нервной ткани в оптогенетических экспериментах. Спасибо за просмотр.