Live-ячейки изображения по переносу клеток, экспрессирующих флуоресцентно с метками Белки в трехмерной матрице

Клеточных процессов, таких как сотовые миграции традиционно изучался на двумерных, жесткие пластмассовые поверхности. В настоящем докладе описывается методика визуализации белка непосредственно локализации и анализа динамики белков в клетках, мигрирующих в физиологически более актуальной, трехмерные матрицы.

Эта демонстрация направлена на получение изображений флуоресцентно помеченных белков в живых клетках в 3D-матрице. Во-первых, генерируются стабильные клеточные линии, экспрессирующие флуоресцентно меченые белки. Поместите эти клетки в 3D-коллагеновую матрицу, а затем получите покадровые изображения мигрирующих клеток с помощью конфокального микроскопа.

В конечном счете, результаты проливают свет на локализацию и динамику белков в мигрирующих клетках с помощью покадровой визуализации и анализа FP, наблюдения за динамикой и локализацией белков в 3D и в режиме реального времени. Предлагает один из путей решения фундаментальных вопросов в области миграции клеток. Например, как адгезивные контакты регулируются цитоплазматическими белками?

А также как эти контакты возмущаются специфическими ингибиторами. В чашке P 35 клетки при беглости от 80 до 90% co трансфицируют клетки интересующей плазмидой с использованием lipo 2000 в соответствии с инструкциями производителя. Затем поместите клетки в инкубатор.

На следующий день разделите клетки на две Р одной чашки Петри по 50 и инкубируйте в течение ночи. Пополнить среду добавить 50 мкг на миллилитр G четырех 18. Продолжайте бактериологическое исследование при подборе антибиотика в течение двух недель.

Исследуйте культуру на наличие G четырех 18 устойчивых колоний. Затем с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа. Идентификация и маркировка GFP-положительных колоний.

Дважды промойте клетки PBS. После второго промывки оставьте тонкий слой жидкости, чтобы предотвратить пересыхание клеток для каждой помеченной колонии. Протрите как можно ближе по краю стерилизованным ватным тампоном и нанесите пипеткой 10 микролитров трипсина на колонию.

Быстро повторите для каждой колонии. Затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов по Цельсию для отделения клеток. Проверьте внешний вид круглой формы под микроскопом.

Добавьте по 10 микролитров трипсина на каждую колонию, пипеткой, чтобы полностью отделить клетки от пластины. Затем перенесите каждую колонию клеток в одну лунку 24-луночной чашки для амплификации стабильных колоний. Затем оцените экспрессию белков колоний с помощью стандартного вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции.

Расширение выделенных линий ячеек модификации поверхности стекла. Нижняя чашка обеспечивает оптимальное связывание коллагена. Нанесите пипеткой 300 микролитров раствора силосизации на стеклянную часть каждой чашки P 35 с отверстием 10 миллиметров.

Выдерживать в течение одного часа при комнатной температуре. Отсадите раствор и промойте фильтрованной водой трижды по 10 минут каждый. Удалите воду и поставьте посуду на горячую плиту при температуре 50 градусов Цельсия на 1,5 часа.

Расположите верхушки посуды немного от посуды, чтобы дать возможность высохнуть. После того, как сухая посуда остынет, пипетку нанесите 300 микролитров 2%-ного раствора глутаральдегида на стеклянную часть каждой посуды. Выдерживать в течение часа, затем мыть PB S3 раза по 10 минут.

Приступайте к стерилизации посуды под воздействием ультрафиолетового излучения в течение одного часа. Сначала гранулируют 100 микролитров флуоресцентных индикаторных частиц методом центрифугирования. Выбросьте жидкость и повторно суспензируйте частицы в 500 микролитрах среды.

Выполните пять стирок, затем повторно суспендируйте частицы в 30 микролитрах среды. Далее соберите GFP-экспрессирующие клетки с помощью трипсина и приготовьте суспензию из 2 миллионов клеток на миллилитр в пипетку эйнора 240 микролитров питательной среды. Добавьте 12,6 микролитров одного молярного массива, 20 микролитров фильтрованной воды, 50 микролитров клеточного раствора и 10 микролитров флуоресцентных частиц.

Наконец, добавьте 167 микролитров коллагена бычьей дермы, один раствор тщательно перемешайте. Теперь переложите 80 микролитров на стеклянную часть подготовленной силосной посуды. Инкубируйте при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 50 минут, чтобы гель полимеризовался.

Затем аккуратно добавьте два миллилитра питательной среды. Уравновесьте камеру микроскопа до установившейся температуры 37 градусов по Цельсию для восполнения клеточной среды. Чтобы поддерживать нейтральный pH для получения изображений ДВС-синдрома, замените верхнюю часть чашки на стеклянную столешницу с тонкой полоской параформы.

Накройте боковую стенку посуды, чтобы предотвратить испарение для цели погружения в масло. Нанесите одну каплю погружной жидкости на положение объекта. Коллагеновый гель, содержащий чашку, находится на предметном столике микроскопа, чтобы чашка соприкасалась с иммерсионной жидкостью.

Сфокусируйте образец и выполните поиск ячеек, представляющих интерес для изображения, чтобы свести к минимуму дрейф сцены. Дайте блюду отстояться около 45 минут. Перед началом длительной съемки укажите параметры получения изображения для экспериментов по добавлению ингибиторов.

Приготовьте дополненную среду с препаратом в нужной рабочей концентрации. Пополняйте клеточную среду для поддержания нейтрального pH, но не запечатывайте перфилом. Перенесите образец в микроскоп и приступайте к визуализации во время медикаментозного лечения.

Поставьте изображение на паузу, сделайте его и осторожно снимите верхнюю часть блюда, не потревожив его. Аспирируйте среду и внесите содержащую лекарственный препарат среду в чашку. Затем аккуратно переложите блюдо.

Верхняя настройка frap зависит от системы. Поэтому обратитесь к инструкции производителя. Сначала задаем параметры для визуализации живых клеток.

Для фотоотбеливания. Проверьте эти параметры на тренировочных клетках, чтобы получить достаточную мощность лазера для фотообесцвечивания флуоресцентного сигнала без повреждения клетки. Далее приступайте к съемке изображения на образце, получая не менее пяти кадров.

Затем фотоотбеливаем интересующую область. Продолжайте захват в течение всего времени восстановления. Измерьте среднюю интенсивность флуоресценции на фотообесцвеченной области до и после фотообесцвечивания с течением времени с помощью программного обеспечения для статистического анализа.

Подгонка кривой восстановления под экспоненциальное уравнение. Получение параметров для полутайма и конечной интенсивности из кривой экспоненциальной аппроксимации. Затем рассчитайте подвижную дробь, взяв отношение конечной и начальной интенсивностей флуоресценции.

Эти 3D-изображения живых клеток показывают здоровые эпителиальные клетки, экспрессирующие актин GFP. После четырех дней культивирования эти клетки образовали кисту в 3D-коллагеновой матрице. Некоторые клетки мигрировали вдоль поверхности кисты, в то время как другие мигрировали внутри кисты.

Деформация матрицы в результате тяговых сил, оказываемых мигрирующими ячейками, анализируется через смещение индикаторных частиц, внедренных в окружающую матрицу. Показано влияние ингибирования РО-киназы на тяговую силу. Движения индикаторных частиц отображаются в виде изображения максимальной проекции различных временных точек, и каждая временная точка является псевдоцветной.

В качестве альтернативы изображения отдельной частицы-индикатора отображаются в виде монтажа, показывающего движение частицы-индикатора. Со временем эта частица-индикатор перемещалась к заднему краю мигрирующей ячейки и от него до и после добавления Y 2 7 6 3 2 соответственно. Анализ frap отслеживает клетки, экспрессирующие GFP-актин, по мере их миграции в трехмерной матрице, что указывает на типичное восстановление флуоресценции После эксперимента по фотообесцвечиванию в оптимизированных лазерных настройках интенсивность флуоресценции исследуемой области заметно снижается по сравнению с фоновым уровнем, сохраняя при этом здоровые и неповрежденные клетки.

На этом графике показано соответствие кривой восстановления экспоненциальной функцией. После освоения засев ячеек в матрице может занять час. Не забывайте, что работа с тремя аминопропилтриметилами может быть крайне опасной.

Поэтому примите меры предосторожности, например, при работе в химическом вытяжном шкафу. Также не забывайте поддерживать стерильные условия при работе с клетками в 3D-матрице.