Live-ячейки изображения по переносу клеток, экспрессирующих флуоресцентно с метками Белки в трехмерной матрице

Данная демонстрация направлена на визуализацию белков с флуоресцентными метками в живых клетках в 3D-матриксе. Сначала создают стабильные клеточные линии, экспрессирующие белки с флуоресцентными метками. Затем эти клетки высевают в 3D-коллагеновый матрикс и получают серию изображений мигрирующих клеток с помощью конфокального микроскопа в режиме таймлапс.

В конечном счете, результаты позволяют осветить локализацию и динамику белков в мигрирующих клетках с помощью таймлапс-визуализации и анализа флуоресцентных белков, что дает возможность наблюдать за динамикой и локализацией белков в 3D и в режиме реального времени. Это открывает путь к решению фундаментальных вопросов миграции клеток. Например, каким образом цитоплазматические белки регулируют адгезионные контакты?

А также то, как эти контакты нарушаются под воздействием специфических ингибиторов. В чашку для культивирования P 35 с клетками при конфлюэнтности 80–90% трансфецируйте клетки интересующей плазмидой, используя Lipofectamine 2000 согласно инструкциям производителя. Затем поместите клетки в инкубатор.

На следующий день распределите клетки по двум чашкам Петри 100 мм и инкубируйте в течение ночи. Обновите среду, добавив 50 µg/mL G418. Продолжайте культивирование с селекцией антибиотиками в течение двух недель.

Осмотрите культуру на наличие резистентных колоний G four 18. Затем с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа идентифицируйте и отметьте GFP-положительные колонии.

Дважды промойте клетки раствором PBS. После второго промывания оставьте тонкий слой жидкости вокруг каждой отмеченной колонии, чтобы предотвратить высыхание клеток. С помощью стерильного ватного тампона максимально аккуратно промокните область вокруг края колонии и нанесите пипеткой 10 µL трипсина на колонию.

Быстро повторите процедуру для каждой колонии. Затем инкубируйте планшет при 37 °C для открепления клеток. Под микроскопом убедитесь, что клетки имеют округлую форму.

Добавьте по 10 µL трипсина на каждую колонию, затем используйте пипетку для полного отделения клеток от планшета. Перенесите каждую колонию клеток в отдельную лунку 24-луночного планшета для культивирования с целью амплификации стабильных колоний. Затем оцените экспрессию белка в колониях с помощью стандартного вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции.

Вырастите выбранные клеточные линии, модифицировав поверхность стекла. Нижняя часть чашки обеспечивает оптимальное связывание коллагена. Пипетируйте 300 µL раствора для силилирования на стеклянную часть каждой чашки P 35 с отверстием 10 mm.

Инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Отсосите раствор и трижды промойте фильтрованной водой по 10 минут каждый раз. Удалите воду и поместите чашки на нагревательную плиту при температуре 50 °C на 1,5 часа.

Расположите крышки чашек слегка со смещением, чтобы обеспечить высыхание. После охлаждения высушенных чашек нанесите пипеткой 300 µL 2% раствора глутарового альдегида на стеклянную часть каждой чашки. Инкубируйте в течение одного часа, затем промойте PBS 3 раза по 10 минут.

Перейдите к стерилизации чашек путем воздействия УФ-излучения в течение одного часа. Сначала осадите 100 µL флуоресцентных трассирующих частиц путем центрифугирования. Удалите жидкость и ресуспендируйте частицы в 500 µL среды.

Выполните пять промывок, затем ресуспендируйте частицы в 30 µL среды. Далее соберите экспрессирующие GFP клетки с помощью трипсина и приготовьте суспензию из 2 миллионов клеток на мл в микроцентрифужной пробирке. Пипетируйте 240 µL ростовой среды. Добавьте 12,6 µL 1 M HEPES, 20 µL фильтрованной воды, 50 µL клеточного раствора и 10 µL флуоресцентных частиц.

Наконец, добавьте 167 µL коллагена дермы быка, затем тщательно перемешайте раствор. Перенесите 80 µL на стеклянную часть подготовленного силиконизированного планшета. Инкубируйте при 37 °C в течение 50 минут до полимеризации геля.

Затем осторожно добавьте 2 mL ростовой среды. Дождитесь стабилизации температуры в камере микроскопа до 37 °C и обновите клеточную среду. Чтобы поддерживать нейтральный pH для DIC-визуализации, замените верхнюю часть чашки на стеклянную крышку с тонкой полоской парафильма.

Накройте боковую часть чашки, чтобы предотвратить испарение при использовании объектива с масляным погружением. Нанесите одну каплю иммерсионной жидкости на позицию объектива. Поместите чашку с коллагеновым гелем на предметный столик микроскопа так, чтобы чашка соприкасалась с иммерсионной жидкостью.

Сфокусируйте образец и найдите интересующие клетки для съемки, чтобы минимизировать дрейф предметного столика. Дайте чашке отстояться примерно 45 минут. Перед началом длительного захвата изображений задайте параметры сбора данных для экспериментов с добавлением ингибитора.

Приготовьте дополненную среду с препаратом в требуемой рабочей концентрации. Обновите клеточную среду для поддержания нейтрального pH, но не запечатывайте её перфилем. Перенесите образец под микроскоп и приступите к визуализации в момент введения препарата.

Остановите изображение, захватите и осторожно снимите крышку чашки, не задевая саму чашку. Аспирируйте среду и перенесите пипеткой среду, содержащую препарат, в чашку. Затем осторожно верните крышку на место.

Оптимальная настройка FRAP варьируется в зависимости от системы, поэтому следует руководствоваться инструкциями производителя. Сначала установите параметры для визуализации живых клеток.

Для фотообесцвечивания. Протестируйте эти параметры на тренировочных клетках, чтобы подобрать достаточную мощность лазера для фотообесцвечивания флуоресцентного сигнала без повреждения клетки. Затем начните захват изображений образца, получив не менее пяти кадров.

Затем проведите фотовыцвечивание интересующей области. Продолжайте регистрацию изображений в течение времени восстановления. С помощью программного обеспечения для статистического анализа измерьте среднюю интенсивность флуоресценции в области фотовыцвечивания до и после процедуры в зависимости от времени.

Приведите кривую восстановления к экспоненциальному уравнению. Определите параметры времени полувыживания и конечной интенсивности по кривой экспоненциальной аппроксимации. Затем рассчитайте мобильную фракцию, определив отношение конечной интенсивности флуоресценции к начальной.

На этих 3D-изображениях живых клеток показаны здоровые эпителиальные клетки, экспрессирующие GFP-актин. После четырех дней культивирования эти клетки образовали кисту в 3D-коллагеновом матриксе. Некоторые клетки мигрировали по поверхности кисты, в то время как другие мигрировали внутри нее.

Деформация матрицы в результате воздействия сил тяги мигрирующих клеток анализируется по смещению частиц-трассеров, внедренных в окружающую матрицу. Здесь показан эффект ингибирования ROCK-киназы на силу тяги. Движения частиц-трассеров представлены в виде изображения с максимальной проекцией для различных временных точек, каждая из которых обозначена псевдоцветом.

В качестве альтернативы изображения отдельной трассирующей частицы представлены в виде монтажа для демонстрации ее перемещения. Со временем эта трассирующая частица двигалась по направлению к заднему краю мигрирующей клетки и затем от него соответственно до и после добавления Y 2 7 6 3 2. Анализ FRAP проводится на клетках, экспрессирующих GFP-актин, в процессе их миграции в трехмерном матриксе, что демонстрирует типичное восстановление флуоресценции. После эксперимента по фотообесцвечиванию при оптимизированных настройках лазера интенсивность флуоресценции в интересующей области заметно снижается по сравнению с уровнем фона, при этом клетки остаются жизнеспособными и неповрежденными.

На этом графике показано соответствие кривой восстановления экспоненциальной функции. После освоения метода посев клеток в матрикс может занять один час. Не забывайте, что работа с аминопропилтриметилсиланом может быть крайне опасной.

Поэтому соблюдайте меры предосторожности, например, работайте в вытяжном шкафу. Также помните о необходимости поддержания стерильных условий при работе с клетками в 3D-матриксе.