Name: Амид водород / дейтерий бирже и MALDI-TOF масс-спектрометрии Анализ Pak2 активации (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Изучите метод MALDI-TOF масс-спектрометрии для анализа обмена водорода/дейтерия при активации протеинкиназы Pak2. Этот подход позволяет исследовать конформационные изменения белка и динамику его структуры.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа частично поддержана из Национального института здоровья Грант GM-26738 (к JAT).

1. Pak2 активации <ol><li> Добавить соответствующие предварительные испытания количество каспазы 3 до 20 мкл 12 мг / мл Pak2 в буфере (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT при рН 7,5) и инкубировать при температуре 34 ° С в течение 30 мин полностью расщепляют и активируют Pak2. </li><li> Анализ расщепления продуктов SDS-PAGE (10%) и Coommassie синего окрашивания. </li><li> Добавить расщепляется Pak2 к активации буфера B (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 15 мМ MgCl 2, 10 мМ АТФ) при рН 7,5, в 20 мкл до конечной концентрации 10 мг / мл Pak2, и инкубировать при 34 ° С в течение 30 минут, чтобы полностью активировать Pak2 по аутофосфорилирование на 8 мест. </li><li> Подтверждение полной расщепления Pak2 по миграции p34 и p27 фрагментов, как это определено SDS-PAGE 10. Правильная проверка аутофосфорилирование условиях осуществляется через авторадиографии в отдельном эксперименте с использованием (32 P), АТФ или масс-спектрометрии для обнаружения фосфопептидов. </li></ol> 2. Идентификацияпепсина-дайджестом Pak2 Фрагменты <ol><li> Добавьте 1 мл 0,1% Trifluroacetic кислота (ТФК) при рН от 2,5 до мытья агарозном бисером дважды перед использованием. Тогда, центрифуга образцы в течение 15 сек при 2000 мкг для удаления бисером. </li><li> Добавить Pak2 (20 мкг в 2 мкл 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl и 2 мМ DTT при рН 7,5) до 100 мкл 0,1% TFA и инкубировать образца в течение 5 мин с 30 мкл пепсина-сопряженных бисером агарозном . </li><li> Уравновешивать обратный ВЭЖХ C18 колонке с основной системой растворителей в размере 0,1% TFA при рН 2,5. Пепсина переваривать (50 мкл) вымывают с помощью линейного 100-мин градиентом 0 - 80% ацетонитрила, содержащего 0,1% ТФУ при скорости потока 0,2 мл / мин. Фракции собираются каждые 2 мин. </li><li> Сухой ВЭЖХ фракции со скоростью-VAC (3 ч) и ресуспендируйте образцов в растворе ацетонитрила (5 мкл) и 0,1% TFA (5 мкл) при рН 2,5. </li><li> Первоначально, каждая фракция, проверенной на пептиды использованием MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, Калифорния, США). </li><li> 16 фракций, содержащих пептиды подвергаются тандемной масс-спектрометрии использованием Q-TOF масс-спектрометра и QStar XL oMALDI MS / MS для идентификации фрагментов. </li><li> Последовательность каждого пептида проверяется продукт ионов порожденных тандемной масс-спектрометрии с теоретическими т / г коэффициенты, связанные с первичной последовательности Pak2 использовании сайта белка Prospector ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. Измерение Амид H / D бирже <ol><li> Держите всех растворов и реагентов, необходимых для H / D обмена при 25 ° С на водяной бане. АТФ растворяют в воде и доводят рН до 7,0 до использования. Дополнительные 4 мм АТФ в D 2 O буфер для предотвращения АТФ отделена от Pak2 после разбавления. </li><li> Инициировать H / D обмена путем добавления 18 мкл буфера D 2 O (50 мМ MOPS рН 6,98, 125 мМ NaCl) до 2 мкл (20 мкг) Из Pak2 в буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5) и 2 мМ DTT, в результате чего Pak2 уровне 10 мг / мл и рН 7,0 при 0 ° C. </li><li> Инкубируйте образцы в трех экземплярах, H / D обмен на 0, 0,5, 1, 3, 5 и 10 мин, или 24 ч. </li><li> Quench H / D процесса обмена путем добавления 180 мкл ледяной 0,1% ТФУ при рН 2,2, который приносит рН до 2,5 в конечном объеме 200 мкл. Для образцов, содержащих АТФ, 180 мкл ледяной 0,11% TFA при рН 2,2 используется для поддержания рН на уровне 2,5 в закаленном состоянии. </li><li> Добавить аликвоты (100 мкл) каждого закаленного образца до 30 мкл активированного пепсина-сопряженных бисером агарозы. Переваривание пепсином разрешено приступить к работе на льду в течение пяти минут и образцы встряхивали каждые 30 сек. </li><li> Завершить пищеварения путем центрифугирования образца в течение 15 сек при 5000 мкг при 4 ° С для удаления пепсина. </li><li> Быстрое замораживание образцов в жидком N 2 и хранить при температуре -80 ° С в течение не более 2дней до MALDI-TOF анализа. </li><li> Матрицы для MALDI составляет 5 мг / мл α-циано-4-гидроксикоричных кислоты (CHCA) растворяют в растворе (1:1:1) ацетонитрила, этанола и 0,1% TFA при рН 2,5 и выдерживают при 0 ° C. </li><li> Частично оттепели каждого образца и быстро смешайте 1 мкл каждого образца с 1 мкл матрицы и пятно на 4 ° С пластиной целевой MALDI. </li><li> Применить умеренной вакуума пластины сухие пятна в 30 сек до MALDI-TOF анализа. Время между таянием образца и спектр поиска составляет около 3 мин. </li><li> Приобретать MALDI-TOF масс-спектров с PerSeptive Biosystems STR Voyager DE. Приобретать данных на 2-ГГц частота дискретизации в 100 000 каналов передачи данных, с 20 000-V ускоряющего напряжения, а 65% сетке напряжение, используя задержки экстракции с 180-нс импульс задержки. Сто сканирует усредняются в 2 мин. MALDI-TOF прибор не ограничивается какой-либо марки или какого-либо конкретного программного обеспечения. </li><li> Используйте Data Explorer 4,0 компьютерную программу, чтобы исчислениеели дейтерирования каждого фрагмента. </li><li> Рассчитать обратно обмена основан на отношение фактической включены дейтрона числа в 24 ч H / D обмена делится на всех возможных сменных сайты, которые являются основой амиды, кроме N-терминал амид (рис. 1). </li></ol> 4. Представитель Результаты: Расщепление каспаз и аутофосфорилирования проверяются SDS-PAGE окрашивания Commassie. Неактивные Pak2 является одной полосы в 58 кДа. Каспаз расщепления Pak2 завершена, и производит два осколка, p27 и p34, которые мигрируют по отдельности. Миграция аутофосфорилированную p27 и p34 показывает перекрытия на геле из-за отсталых миграции полностью фосфорилированного р27 фрагмента (рис. 2). H / D обмена эксперименты проводятся несколько раз от 0 до 10 мин (рис. 3). В качестве примера, время конечно дейтерия включения в м / грЕАК 1697,85 неактивных Pak2 состоит из нескольких изотопных пиков как показывает смещение масс конверт с течением времени. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> Рисунок 1. Уравнение для расчета дейтерирования. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> Рисунок 2. Аутофосфорилирование и каспазы расщепления Pak2. Каспазы-расщепляется Pak2 (левая полоса), неповрежденные неактивных Pak2 (средней полосе) и каспазы-расщепляется аутофосфорилированную Pak2 (правая полоса) были проанализированы SDS-PAGE и Coommassie синего окрашивания. По материалам Хсу, YH и др. 2. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> Рисунок 3. Масс-спектр время курс дейтерия включения для неактивных Pak2. Неактивные Pak2 подвергался H / D exchaНге за 0-10 мин и проанализированы MALDI-TOF. Пример расширенного изотопного распределения MALDI-TOF пика т / г 1697,85 во время хода H / D обмена показано на рисунке. Красная пунктирная линия показывает среднее значение массы оболочки и смещение масс конверт показывает дейтерирование пептида.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
<li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li>
<li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2%2B-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li>
<li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li>
<li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li>
<li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li>
<li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam.+Horm%22%5BJournal%5D)">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li>
<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Определение Пепсин-дайджестом Фрагменты является важным шагом в H / D эксперимент обмена. Неправильная идентификация пептида может привести к неправильному выводу. Пепсин-переваренной Pak2 вымывается через обратный ВЭЖХ C18 колонке для получения чистой фона. В наших экспериментах в общей сложности 40 фракций были собраны и подвергнуты MALDI-TOF. Несколько пептиды могут быть определены в каждой из фракций. Пептиды были подвергнуты тандемной масс-спектрометрии (Q-TOF MS / MS и oMALDI MS / MS) для определения их последовательности. MS / MS спектры пептида должны иметь не менее трех ионов продукт для подтверждения идентификации пептида. Данные Explorer 4.0 Компьютерная программа (Applied Biosystems) выполняет начальную коррекция базовой линии и фильтрации шума. Каждый спектр должен быть откалиброван на базе двух последовательных пиков. Мы калибровку наших спектра теоретическая масса undeuterated т / г, которые 923,45 и 1697,84. ТОн массы точность после калибровки может достигать 10 частей на миллион. По дейтерирования, моно-изотопов могут перейти на более высокую массу. Унитарное увеличивает шаг к этим т / г соотношение дали расширенной масс связано с дейтерирования. Пик интенсивности массы конверте не повлияет дейтерирования уровне. Тем не менее, пик интенсивности изотопных пиков в частности массы оболочки имеют решающее значение для расчета средней массы. Первый шаг расчет включены дейтрона вычитания пептид массой, не дейтерированного образца из дейтерированного образца. Три других факторов, D 2 O разбавления, остаточная дейтронов в боковые цепи и обратно обмена, должны быть дополнительно рассмотрены в расчет (рис. 1). D 2 O разведения коэффициент разбавления D 2 O после смешивания образца и D 2 O буфера инициировать H / D обмена. Остаточные дейтрона (4,5%), в боковых цепей пепсина-дайджестред пептидов необходимо вычесть. Резервное обмен неизбежные потери дейтерирования во всех дейтерированных и пепсина-переваренной пептидов в процессе измерения массы. Наиболее доступным растворителя пептид (м / г = 1105,60), после 24-часового Н / D обмена представляет собой полный регионе дейтерирования. Включены дейтрона номер для каждого из пептидов представляет собой разницу между центром тяжести дейтерированных и не дейтерированного Pak2 пептидов язвенной. Наиболее дейтерированных пептида т / г 1105 был выбран для представления полной дейтерирования когда Pak2 был в 24 ч H / D обмена. Вернуться коэффициент обмена был рассчитан путем фактического включены дейтрона числа в 24 ч H / D обмена делится на всех возможных сменных сайтов на пептида т / г 1105.

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии (необязательно) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Aldrich </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-циано-4-гидроксикоричных кислоты </td><td> Сигма </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> Voyager DE STR </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF масс-спектрометра </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QStar XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Данные Explorer 4.0 Компьютерная программа </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tг&gt; </tbody></table>

Амид водород / дейтерий бирже и maldi-tof масс-спектрометрии Анализ pak2 активации

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Амид водород / дейтерий обмена (H / D обмена) в сочетании с масс-спектрометрии широко используется для анализа интерфейс белок-белковых взаимодействий, белка конформационные изменения, динамики белков и белок-лиганд. H / D обмена на позиции позвоночник амид был использован для измерения дейтерирования темпы микро-регионов белка методом масс-спектрометрии 1,2,3. Разрешение этого метода зависит от пепсина переваривания дейтерированных белок на пептиды, которые обычно в диапазоне от 3-20 остатков. Хотя разрешение H / D обмена измеряется методом масс-спектрометрии ниже, чем одной резолюции остаток измеряется Гетероядерные одиночной квантовой когерентности (HSQC) методом ЯМР, масс-спектрометрия измерения в H / D обмена не ограничен размер белок 4. H / D обмена осуществляется в водном растворе, который поддерживает конформации белка. Мы предлагаем метод, который Utilхарактеризует MALDI-TOF для обнаружения 2, вместо того, чтобы HPLC / ESI (электрораспылением ионизации)-системы MS 5,6. MALDI-TOF обеспечивает получение точных данных интенсивности массы для пептиды усваиваются белки, в этом случае протеинкиназы Pak2 (также называется γ-Pak). Протеолиз Пак 2 проводится в автономном пищеварения пепсина. Этот альтернативный метод, когда пользователь не имеет доступа к высокоэффективной жидкостной хроматографии и пепсина колонки подключены к масс-спектрометрия, или когда пепсина колонке HPLC не приводит к оптимальным карте пищеварения, например, сильно дисульфидными связями выделяются фосфолипазы 2 (SPLA 2). Используя этот метод, мы успешно мониторинг изменений в дейтерирования уровне во время активации Pak2 по каспазы 3 расщепления и аутофосфорилирования 7,8,9.

MALDI-TOF масс-спектрометрии была успешно использована для контроля амид водород / дейтерий обмена белка активации киназы Pak2.

Амид водород / дейтерий бирже и MALDI-TOF масс-спектрометрии Анализ Pak2 активации

Метод обмена водорода на дейтерий в амидных группах (H/D-обмен) в сочетании с масс-спектрометрией широко применяется для анализа интерфейса белок-белковых...

В данном эксперименте демонстрируется использование масс-спектрометрии для мониторинга гибридно-дейтериевого обмена в белках. Структурные изменения, приводящие к состояниям активации, инициируются путем расщепления протеинкиназы PAC2 каспазой-3 с последующей активацией PAC2 посредством аутофосфорилирования с использованием ATP в качестве субстрата. На втором этапе PAC2 подвергают перевариванию пепсином и анализируют фрагменты PAC2 с помощью тандемной масс-спектрометрии. Затем проводится анализ паттернов гибридно-дейтериевого обмена PAC2 путем мониторинга уровня дейтерия в каждом фрагменте PAC2. Точное определение уровня гибридно-дейтериевого обмена с использованием анализа масс-спектрометрии дает важные сведения о расщеплении PAC2 каспазой-3 и ее аутофосфорилировании.Данный метод позволяет ответить на вопросы о динамике белков, такие как конформационные изменения белков, взаимодействия белков с лигандами и белок-белковые взаимодействия. Основное преимущество этого метода перед существующими подходами, такими как масс-спектрометрия LCQ с HD-обменом, заключается в инструментальном обеспечении. Данная процедура не требует использования масс-спектрометра, соединенного с ВЭЖХ, для анализа результатов HD-обмена, и проста в исполнении для расщепления 0.6 micrograms PAC two.Добавьте каспазу 3 и инкубируйте реакционную смесь при 34 °C в течение 30 минут. Подтвердите наличие PAC 2 и полное расщепление PAC 2 путем анализа продуктов с помощью SDS-PAGE. Для реакции активации добавьте расщепленный PAC 2 к 20 µL буфера для активации B и инкубируйте при 34 °C в течение 30 минут.Используйте SDS-ПААГ для подтверждения автофосфорилирования по миграции фрагментов P 34 и P 27. Сначала дважды промойте пурин-конъюгированные агарозные бусины одним миллилитром 0,1% трифторуксусной кислоты, разведите два микролитра раствора с концентрацией 10 мг/мл Pak2 в 100 микролитрах 0,1% TFA, добавьте 30 микролитров промытых пурин-конъюгированных агарозных бусин и инкубируйте в течение пяти минут.Приступайте к уравновешиванию колонки для обращенно-фазовой ВЭЖХ C18 с использованием 0,1% TFA при pH 2,5. Затем внесите Pepin Digest и проведите элюцию, используя линейный 100-минутный градиент. Собирайте фракции каждые две минуты после высушивания фракций ВЭЖХ на вакуум-концентраторе SpeedVac.Суспендируйте образцы в 5 µL ацетонитрила и 0,1% TFA при pH 2,5. В качестве первичного скрининга проанализируйте каждую фракцию на наличие пептидов с помощью MALDI для всех фракций, содержащих пептиды.Идентифицируйте фрагменты с помощью тандемной масс-спектрометрии. Используйте функцию MS product в программе Protein Prospector для сопоставления дочерних ионов с теоретическими значениями m/z на основе первичной последовательности PAC two. Сначала доведите все растворы и реагенты для водородно-дейтериевого обмена до равновесного состояния.Запустите реакцию гибридно-дейтериевого обмена, добавив 18 µL буфера D₂O к 2 µL раствора с концентрацией 10 mg/mL. Для второй группы образцов проведите реакции в трехкратной повторности в течение заданного периода времени. Остановите реакцию гибридно-дейтериевого обмена, добавив 180 µL ледяного 0,1% TFA при pH 2,2.Теперь распределите аликвоты водорода-дейтерия по 100 µL. Добавьте по две аликвоты к 30 µL активированных бусин с конъюгатом пепсина. Инкубируйте эту смесь с пепсином на льду в течение пяти минут.Перемешивание на вортексе каждые 30 секунд эффективно прекращает реакции переваривания; затем проводят центрифугирование для быстрого удаления пепсина. Образцы замораживают в жидком азоте для последующего анализа. Готовят матрицу и хранят её при 0 °C, после чего каждый образец быстро частично размораживают.Смешайте 1 µL образца с 1 µL матрицы, затем нанесите смесь на мишень, охлажденную до 4 °C, за 30 секунд до начала анализа. Примените к пластине умеренный вакуум для высушивания. Продолжайте сбор масс-спектров до получения в среднем 100 сканов за две минуты.Используйте компьютерную программу Data Explorer 4.0 для расчета длительности каждого фрагмента. Затем рассчитайте обратный обмен на основе отношения фактического включения по количеству через 24 часа водород-дейтериевого обмена к общему числу всех возможных обменных сайтов, которыми являются амиды основной цепи, за исключением концевого терминального амида. В данном примере расщепление и автофосфорилирование CASP Bay подтверждаются электрофорезом в ПААГ с окрашиванием Кумази.Нефосфорилированная неактивная форма PAC2 представляет собой одну полосу с молекулярной массой 58 кДа. После автофосфорилирования расщепление PAC2 происходит полностью, в результате чего образуются два фрагмента: P27 (регуляторный домен) и P34 (каталитический домен). На белковом геле миграция автофосфорилированных P27 и P34 перекрывается из-за замедления миграции полностью фосфорилированного фрагмента P27 по сравнению с нефосфорилированным PAC2.На этом масс-спектре представлен временной ход включения дейтерия для неактивного PAC two. Пик MZ 1697.85 состоит из нескольких изотопных пиков, о чем свидетельствует смещение масс-конверта. Красная пунктирная линия показывает среднее значение масс-конверта с течением времени, а смещение масс-конверта указывает на время освоения пептида.При правильном выполнении данную методику можно завершить за два дня. Не забывайте, что работа с жидким азотом может быть крайне опасной, поэтому соблюдайте меры предосторожности, например, проделывайте отверстие в крышке пробирки EOL объемом 1,5 мл перед ее погружением в жидкий азот.

amide-hydrogendeuterium-exchange-maldi-tof-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Лейцин Богатые киназы Повторите 2 является большой киназы многодоменных, мутации в которых наиболее распространенных генетических причин болезни Паркинсона. Анализ активности киназы этого белка оказалась важнейшим инструментом в понимании биологии и дисфункции этого белка. В данной...

Опробование киназы Деятельность LRRK2 В пробирке</em

Конформации белка и динамика являются ключевыми для понимания взаимосвязи между структурой и функции белка. Обмен водорода в сочетании с масс-спектрометрии высокого разрешения является универсальным методом для изучения конформационной динамики белков, а также характеризующие белок-лиганд и белок-белковых взаимодействий, в том числе контактных интерфейсов и аллостерических эффектов.

Анализируя Динамика белков с использованием водорода валютный масс-спектрометрии

Мы описываем здесь протокол для очистки и характеристики растений белковых комплексов. Показано, что по иммунопреципитации один белок в комплексе, поэтому мы можем определить свои пост-трансляционные модификации и ее взаимодействующих партнеров.

Идентификация пост-трансляционных модификаций растительных белковых комплексов

Использование белковых микрочипов, содержащих почти всю С. Cerevisiae протеом зондируют для быстрого объективной допроса тысяч белок-белковых взаимодействий в параллель. Этот метод может быть использован для белка-малая молекула, посттрансляционной модификации, и других анализов в высокой пропускной.

Исследование высокой плотности белковых Функциональные Microarrays для обнаружения белок-белковых взаимодействий

Конформационная гибкость играет важную роль в функции белка. Здесь мы опишем использование с временным разрешением масс-спектрометрии с ионизацией электрораспыления в сочетании с обменом водородно-дейтериевого для зондирования быстрых структурных изменений, которые ведут функцию в упорядоченных и неупорядоченных белках.

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Протеинкиназы представляют собой высокоразвитые сигнальные ферменты и каркасы, которые являются критическими для меж- и внутриклеточной передачи сигнала. Мы представляем протокол для измерения активности киназы с использованием радиоактивно меченого аденозинтрифосфата ([γ- 32 P] ATP), надежного метода, помогающего выявлять регуляцию клеточной сигнализации.

Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Этот рабочий процесс описывает производительность времени и экономически эффективного обогащения нескольких белковых посттрансляционных модификаций (ПТМ) одновременно для количественного глобального протеомического анализа. Протокол использует пептидного уровня PTM обогащения с несколькими конъюгированными антителами, а затем данные-независимых приобретения масс-спектрометрии анализа для получения биологической информации в PTM перекрестный разговор.

Одновременное обогащение сродства двух постпереводных модификаций для количественной оценки и локализации сайта

Лантипептидные синтезы катализует многоступенчатые реакции во время биосинтеза пептидных натуральных продуктов. Здесь мы описываем непрерывный, снизу вверх, серо-дейтерий обмена масс-спектрометрии (HDX-MS) рабочий процесс, который может быть использован для изучения конформации динамики lanthipeptide синтезетаз, а также других аналогичных ферментов, участвующих в пептид природного продукта биосинтеза.

Платформа масс-спектрометрии обмена водорода и дейтерия (HDX-MS) для изучения пептидных биосинтетических ферментов

Комбинированная изотопная маркировка прекурсоров и изобарическая маркировка (cPILOT) — это усовершенствованная стратегия мультиплексирования образцов, способная увеличить количество образцов, которые могут быть проанализированы одновременно с доступными изобарическими тегами. Включение роботизированной платформы значительно увеличило экспериментальную пропускную способность, воспроизводимость и количественную точность.

Автоматизированная мультиплексирование образцов с помощью комбинированной изотопной маркировки прекурсоров и исобарической маркировки (cPILOT)

Способность оценивать целевое участие ингибиторов-кандидатов в нетронутых клетках имеет решающее значение для обнаружения наркотиков. Этот протокол описывает 384 хорошо формат клеточного теплового сдвига анализ, который надежно обнаруживает клеточной целевой взаимодействия ингибиторов ориентации либо дикого типа SHP2 или его онкогенных вариантов.

Оценка клеточного целевого взаимодействия с помощью ингибиторов PHP2 (PTPN11) Фосфатазы

Здесь мы представляем протокол обогащения эндогенных фосфопротеинфосфатаз и их взаимодействующих белков из клеток и тканей, а также их идентификацию и количественную оценку с помощью протеомики на основе масс-спектрометрии.

Масс-спектрометрический подход к идентификации фосфопротеинфосфатаз и их интеракторов

Изучите метод MALDI-TOF масс-спектрометрии для анализа обмена водорода/дейтерия при активации протеинкиназы Pak2. Этот подход позволяет исследовать конформационные изменения белка и динамику его структуры.

Амид водород / дейтерий бирже и MALDI-TOF масс-спектрометрии Анализ Pak2 активации

Больше видео