Анализ нейронной миграции Крест и дифференциация по межвидовой трансплантации

Общая цель данной процедуры заключается в пересадке экспланта дорсальной части нейральной трубки из эмбриона перепела в соответствующий по стадии развития эмбрион курицы, чтобы проследить за миграцией и судьбой клеток нейрального гребня. Это осуществляется путем создания небольшого отверстия в мембране IGN эмбриона-хозяина (курицы) для получения доступа к нейральной трубе. Затем эмбрион-донор (перепел) извлекается из яйца для подготовки к иссечению трансплантата.

На следующем этапе из нейральной трубки эмбриона-реципиента вырезают интересующую область. Аналогичный участок вырезают из нейральной трубки донора для последующей трансплантации. Затем нейральную трубку донора пересаживают в нейральную трубку реципиента.

Наконец, химерный эмбрион инкубируют до нужной стадии для обнаружения клеток нейрального гребня, достигших выбранного органа. В конечном итоге миграцию и дифференцировку производных от донора клеток нейрального гребня в различных областях эмбриона-хозяина можно визуализировать с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы микродиссекции и трансплантации требуют очень развитой мелкой моторики, что затрудняет их освоение.

Начните с промывания куриных яиц теплой водой для удаления загрязнений. Разместите яйца на лотке горизонтально, затем отметьте карандашом сторону, обращенную вверх, чтобы обозначить область локализации эмбриона. Для подготовки донорских эмбрионов методом X ovo инкубируйте яйца перепелов тупым концом вверх.

Далее поместите яйца в увлажненный инкубатор при температуре 38 °C и включите функцию покачивания. После завершения инкубации стерилизуйте верхнюю часть яиц, распылив 70% ethanol, а затем быстро протрите их салфеткой Kimwipe. Чтобы избежать впитывания жидкости через скорлупу, поместите каждое стерилизованное яйцо в отдельный держатель, например, в чашку Петри, выложенную сложенными салфетками Kimwipe, как показано здесь. Затем с помощью стерильного пинцета сделайте небольшое отверстие в верхней части скорлупы со стороны острого конца яйца.

Оснастите шприц объемом 5 мл иголкой калибра 18,5. Затем, направив срез иглы к остроконечному концу яйца, вертикально введите иглу в отверстие в скорлупе. Чтобы избежать случайного повреждения желтка из-за всасывания, очистите отверстие 70% ethanol, как и прежде, и заклейте его скотчем.

Затем с помощью зажима double A сделайте еще одно отверстие в отмеченной верхней поверхности горизонтальной ножки, но не совсем в ее вершине. После этого вставьте один конец изогнутого ирисного пинцета в отверстие параллельно яйцу. Затем аккуратно сжимайте скорлупу, двигаясь по кругу.

Сделайте в курином яйце отверстие диаметром 2 см и удалите извлеченную часть скорлупы. Эмбрион должен выглядеть как непрозрачный диск на поверхности желтка. Отбракуйте неоплодотворенные яйца, которые определяются по наличию небольшого белого пятна на поверхности желтка или по отсутствию бластердермы.

Теперь, используя соответствующие средства защиты глаз, согните иголку для подкожных инъекций калибра 26,5 под углом 45 градусов, начиная от основания. После прикрепления согнутой иголки срезом вверх к шприцу объемом 1 мл заполните иголку разведенными чернилами «India ink». Проколите желточную мембрану за пределами области бластера и введите кончик иголки под эмбрион, близко к поверхности желтка, но не заходя в слои эмбриона.

Затем введите ровно столько чернил, сколько необходимо, чтобы обвести эмбрион, избегая введения пузырьков воздуха. Осторожно извлеките иглу. Теперь используйте стереомикроскоп и источник света с низкой тепловой нагрузкой, например, оптоволоконную лампу на гибком штативе, показанную здесь.

Определите стадию развития эмбрионов по классификации Hamburger и Hamilton. Запишите стадию на скорлупе яиц. Затем нанесите две-три капли теплого стерильного раствора Рингера на поверхность эмбрионов, чтобы предотвратить дегидратацию и контаминацию.

Затем накройте поверхность яиц парафильмом, чтобы временно герметизировать окна. Далее подготовьте перепелиные яйца к трансплантации. Перед извлечением яиц из инкубатора налейте в чашку Петри раствор Рингера.

Затем с тупого конца вскройте яйца с помощью изогнутого пинцета, чтобы обнажить эмбрион. Используя диссекционные ножницы, сделайте четыре надреза в форме квадрата через виллиозную мембрану и бластердерму вокруг эмбриона, следя за тем, чтобы все разрезы сходились. Затем, используя изогнутый ирисовый пинцет, осторожно захватите один из краев разреза, извлеките эмбрион из яйца и перенесите его в подготовленную чашку Петри.

Наконец, аккуратно удалите вителлинную мембрану с помощью пинцета № 5, затем определите стадию развития эмбрионов под диссекционным микроскопом. Снимите парафильм с эмбриона цыпленка-хозяина. Затем, используя заточенную вольфрамовую иглу, проделайте небольшое отверстие в вителлинной мембране в нужном отделе нейральной трубки.

Добавьте каплю раствора Рингера к эмбриону. Затем для односторонней трансплантации, которая выполняется в данном видео, используйте вытянутую стеклянную иглу, чтобы осторожно сделать поперечные ростральный и каудальный разрезы в области среднего мозга нейральной трубки, не выходя за пределы просвета. Затем выполните двусторонние разрезы между дорсальной частью нейральной трубки и париетальной мезодермой.

Наконец, осторожно отделите вырезанный эксплантат X от нейральной трубки, а затем извлеките его из эмбриона, аспирировав в стеклянную микропипетку. Сначала используйте эмбрион перепела соответствующего стадии развития. Затем вырежьте участок нейральной трубки такого же размера, как показано выше, и аспирируйте донорский эксплантат X в стеклянную микропипетку с раствором Рингера.

Перенесите эксплантат X рядом с иссеченным участком цыпленка-хозяина. Затем, используя вытянутую стеклянную иглу, осторожно направьте эксплантат в область абляции. Осторожно добавьте несколько капель раствора Рингера на эмбрион для предотвращения дегидратации.

Наконец, закройте окно упаковочной лентой, убедившись, что лента полностью герметизирует область окна в яйце, и верните яйцо в инкубатор до достижения нужной стадии; при инкубации химеры отключите функцию раскачивания, при этом яйцо можно осторожно поворачивать вручную дважды в день для повышения жизнеспособности эмбрионов. Если целью являются более поздние стадии развития, то на данном репрезентативном изображении области трансплантации нейральной трубки после шести часов повторной инкубации до стадии HH 11 показана ожидаемая интеграция трансплантированной донорской ткани перепела в нейральную трубку куриного эмбриона. Данный поперечный срез через область трансплантации на стадии HH 11 демонстрирует клетки нервного гребня, помеченные hnk, одна из которых мигрирует латерально от нейральной трубки.

Клетки перепела, участвующие в миграционном потоке клеток нервного гребня и формирующие нервную трубку, четко маркируются с помощью QCPN. На более поздних стадиях можно проследить путь производных клеток нервного гребня перепела до их конечных тканей-мишеней. Как видно на данном рисунке, клетки, маркированные QCPN, распределены в мезенхиме верхнечелюстного отростка эмбриона цыпленка на стадии E5. Антитела QCPN можно легко комбинировать с другими антителами для изучения дифференцировки производных клеток нервного гребня перепела.

В среде хозяина. Как видно здесь, сенсорные нейроны тройничного нерва, производные от клеток нейрального гребня перепела, помечены антителами QCPN и T UJ one. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как иммуногистохимия и гибридизация in situ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например: из каких тканей развиваются клетки нейрального гребня и какие гены экспрессируют эти клетки в процессе дифференцировки в различные ткани.