Анализ нейронной миграции Крест и дифференциация по межвидовой трансплантации

Общая цель данной процедуры заключается в пересадке экспланта дорсальной части нейральной трубки эмбриона перепела в соответствующий по стадии развития эмбрион курицы для отслеживания миграции и дальнейшей судьбы клеток нервного гребня. Для этого сначала в мембране IGN эмбриона курицы-реципиента делается небольшое отверстие для доступа к нейральной трубке. Затем эмбрион перепела-донора извлекают из яйца для подготовки к иссечению трансплантата.

На следующем этапе из нервной трубки эмбриона-реципиента иссекают область интереса. Затем для трансплантации из нервной трубки донора иссекают аналогичную область. После этого фрагмент нервной трубки донора пересаживают в нервную трубку реципиента.

Наконец, химерный эмбрион инкубируют до нужной стадии для обнаружения клеток нейрального гребня, достигших выбранного органа. В конечном итоге миграцию и дифференцировку производных от донора клеток нейрального гребня в различных областях эмбриона-реципиента можно визуализировать с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы микродиссекции и трансплантации требуют очень тонкой моторики, что затрудняет их освоение.

Начните с промывания куриных яиц теплой водой для удаления загрязнений. Расположите яйца горизонтально на лотке, затем отметьте карандашом верхнюю сторону, чтобы обозначить область локализации эмбриона. Для подготовки донорских эмбрионов методом X ovo инкубируйте яйца перепела тупым концом вниз.

Далее поместите яйца в увлажненный инкубатор при температуре 38 °C и включите функцию покачивания. После завершения инкубации стерилизуйте верхнюю часть яиц, распылив 70% ethanol, а затем быстро протрите их салфеткой Kimwipe. Чтобы предотвратить всасывание раствора через скорлупу, поместите каждое стерилизованное яйцо в отдельный держатель, аналогичный чашке Петри, выложенной сложенными салфетками Kimwipe, как показано здесь. Затем с помощью стерильного пинцета AA сделайте небольшое отверстие в верхней части скорлупы с острого конца яйца.

Оснастите шприц объемом 5 мл подкожной иглой калибра 18,5. Затем, направив срез иглы к острому концу яйца, введите иглу вертикально в отверстие в яичной скорлупе. Чтобы избежать случайного повреждения желтка при всасывании, очистите отверстие 70% этанолом, как было описано ранее, и заклейте его скотчем.

Затем с помощью пинцета типа «double A» проколите еще одно отверстие в отмеченной верхней поверхности горизонтальной ножки, чуть ниже вершины. Далее вставьте один конец изогнутого ирис-пинцета в отверстие параллельно яйцу. Затем зажмите скорлупу и совершайте круговые движения.

Сделайте в курином яйце отверстие диаметром два сантиметра и удалите отделенный фрагмент скорлупы. Эмбрион должен выглядеть как непрозрачный диск на поверхности желтка. Отбракуйте все неоплодотворенные яйца, которые определяются по наличию маленького белого пятна на поверхности желтка или отсутствию бластодермы.

Теперь, используя соответствующие средства защиты глаз, согните гиподермическую иглу калибра 26,5 под углом 45 градусов, начиная от основания иглы. После прикрепления согнутой иглы к одномиллилитровому шприцу срезом вверх, заполните иглу разбавленными тушью из Индии. Проколите желточную мембрану за пределами периметра бластера и просуньте кончик иглы под эмбрион, близко к поверхности желтка, но не затрагивая слои эмбриона.

Затем введите достаточное количество чернил, чтобы обвести эмбрион, избегая попадания пузырьков воздуха. Осторожно извлеките иглу. Теперь используйте стереомикроскоп и источник света с низкой тепловой нагрузкой, такой как показанная здесь оптоволоконная гибкая лампа.

Определите стадию развития эмбрионов согласно классификации Гамбургера и Гамильтона. Запишите стадию на скорлупе яиц. Затем нанесите две-три капли теплого стерильного раствора Рингера на поверхность эмбрионов для предотвращения дегидратации и контаминации.

Затем накройте поверхность яиц парафильмом, чтобы временно загерметизировать окна. Далее подготовьте перепелиные яйца к трансплантации. Перед извлечением яиц из инкубатора наполните чашку Петри раствором Рингера.

Затем с помощью изогнутого пинцета вскройте яйца со стороны тупого конца, чтобы обнажить эмбрион. С помощью диссекционных ножниц сделайте четыре разреза в форме квадрата через виллезную мембрану и бластердерму вокруг эмбриона, следя за тем, чтобы все разрезы сходились. Затем, используя изогнутый ирис-пинцет, осторожно захватите один из краев разреза, извлеките эмбрион из яйца и перенесите его в подготовленную чашку Петри.

Наконец, осторожно удалите вителлиновую мембрану пинцетом номер пять, после чего определите стадию развития эмбрионов под диссекционным микроскопом. Снимите парафильм с эмбриона цыпленка-хозяина. Затем, используя заостренную вольфрамовую иглу, сделайте небольшое отверстие в вителлиновой мембране в нужной области нервной трубки.

Добавьте каплю раствора Рингера к эмбриону. Далее, для односторонней трансплантации, как в данном видео, используйте вытянутую стеклянную иглу, чтобы осторожно сделать поперечные ростральный и каудальный разрезы в области среднего мозга нейральной трубки, не выходя за пределы просвета. Затем выполните двусторонний разрез между дорсальной частью нейральной трубки и париетальной мезодермой.

Наконец, осторожно отделите вырезанный эксплантат X от нервной трубки, а затем извлеките его из эмбриона, аспирировав в стеклянную микропипетку. Сначала возьмите эмбрион перепела соответствующей стадии развития. Затем вырежьте участок нервной трубки аналогичного размера, как показано выше, и аспирируйте донорский эксплантат X в стеклянную микропипетку с раствором Рингера.

Перенесите эксплантат X рядом с иссеченной областью хозяина-цыпленка. Затем с помощью вытянутой стеклянной иглы осторожно направьте эксплантат в область абляции. Аккуратно добавьте несколько капель раствора Рингера на эмбрион, чтобы предотвратить обезвоживание.

Наконец, заклейте окошко упаковочной лентой, убедившись, что лента полностью герметизирует область отверстия в яйце, и верните яйцо в инкубатор до достижения нужной стадии; при инкубации химеры функцию раскачивания следует отключить, при этом яйца можно аккуратно поворачивать вручную дважды в день для повышения их жизнеспособности. Если целью являются более поздние стадии развития, то на данном репрезентативном изображении области трансплантации нейральной трубки после шести часов повторной инкубации до стадии HH 11 показана ожидаемая интеграция трансплантированной донорской ткани перепела в нейральную трубку куриного эмбриона-хозяина. Этот поперечный срез через область трансплантации на стадии HH 11 демонстрирует клетки нервного гребня, маркированные hnk, одна из которых мигрирует латерально от нейральной трубки.

Клетки перепела, участвующие в миграционном потоке клеток нервного гребня, а также клетки нервной трубки, четко маркированы с помощью QCPN. На более поздних стадиях можно проследить путь клеток, производных от клеток нервного гребня перепела, до их конечной ткани-мишени. Как видно на этом рисунке, клетки, маркированные QCPN, перемежаются в мезенхиме верхнечелюстного отростка эмбриона цыпленка. На стадии E5 антитела QCPN можно легко комбинировать с другими антителами для изучения дифференцировки клеток нервного гребня, производных от перепела.

В среде хозяина. Как видно здесь, сенсорные нейроны тройничного нерва, производные клеток нервного гребня перепела, помечены антителами QCPN и T UJ one. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как иммуногистохимия и гибридизация in situ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, в какие ткани дифференцируются клетки нервного гребня и какие гены экспрессируют клетки нервного гребня в процессе их дифференцировки в различные ткани.