Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Общая цель данной процедуры заключается в эффективном количественном определении титров вируса гриппа в дыхательных путях инфицированных мышей. Сначала мышам проводят интраназальную инокуляцию вирусом гриппа в выбранные временные точки после инфицирования.

Мышей усыпляют и собирают жидкость для бронхоальвеолярного лаважа или БАЛ. Затем жидкость БАЛ используют для заражения клеток MDCK. Зараженные клетки затем окрашивают на наличие вирусных белков с использованием специфических первичных антител с последующим применением вторичных антител, конъюгированных с инфракрасным красителем.

Инфракрасные сигналы считываются с помощью сканера Lycor Odyssey, а программное обеспечение Odyssey может быть использовано для определения вирусных титров. Количественное определение вирусных титров достигается с помощью стандартной кривой. Основными преимуществами данного метода по сравнению с существующими являются точная количественная оценка вирусных титров, воспроизводимость и малый объем образца, необходимый для проведения данного анализа.

Значимость данного метода может быть распространена на диагностику и терапию различных респираторных вирусных заболеваний, поскольку после выполнения данной процедуры его можно использовать для количественного определения вирусных титров в клинических образцах. Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о числе копий вируса, можно применить другие методы, такие как QPCR. При использовании данной методики важно не забывать проверять стандартный контрольный вирус титра после завершения этого этапа.

Данный метод позволяет исследователям в области вирусологии определять титр вируса или проводить окрашивание вирусных белков в клинических образцах. После освоения данной методики ее выполнение занимает 17 часов. Процедура осуществляется следующим образом: мышам интраназально вводят 5 000 единиц плиточного фактора (PFU) вируса гриппа PR8 в 30 µL стерильного PBS или только PBS в качестве отрицательного контроля. Для сбора бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) из эвтаназированных животных сначала вскрывают грудную клетку и делают разрез длиной 1 см параллельно трахее, чтобы обнажить ее, используя тонкие стерильные ножницы.

Сделайте небольшой надрез в трахее, введите в трахею 0,5 milliliters 1%BSA в PBS и осторожно аспирируйте промывочную жидкость. Храните жидкость БАЛ при температуре -20 degrees centigrade для количественного определения вирусных титров в промывочных жидкостях. Сначала культивируйте 5 million клеток MDCK в 20 milliliters полного RPMI в колбе T 75 в течение ночи при 37 degrees centigrade; на следующий день соберите клетки и посейте их в черный 96-луночный планшет с плоским оптическим дном из расчета 10 000 клеток на лунку.

Затем инкубируйте планшет в течение ночи при 37 °C. Осторожно аспирируйте супернатант и дважды промойте клетки в полноценной, но безсывороточной среде DMEM, содержащей 0,2% BSA вместо FBS. После промывки клеток добавьте в каждую лунку 50 µL жидкости БАЛ или 50 µL суспензии с известной концентрацией вируса.

Затем добавьте в каждую лунку по 50 µL среды DMEM, содержащей трипсин, обработанный TPCK, в концентрации 0,2 µg/mL, для усиления прикрепления, проникновения и репликации вируса. Инкубируйте клетки в течение одного часа при 37 °C для обеспечения абсорбции вируса. Затем добавьте в каждую лунку 100 µL полной среды RPMI, содержащей FBS, и культивируйте клетки в течение ночи для распространения инфекции после завершения ночной инкубации.

Промойте клетки 100 мкл 1% B-S-A-P-B-S. После промывки клеток добавьте в каждую лунку по 100 мкл 1% параформальдегида и инкубируйте планшеты в течение пяти минут при комнатной температуре для фиксации клеток. Затем промойте клетки, добавив по 100 мкл 1% B-S-A-P-B-S в каждую лунку, и инкубируйте их еще 30 минут для блокировки. После блокировки клеток добавьте в каждую лунку по 50 мкл первичных антивирусных антител M2 в разведении 1:1000 и инкубируйте планшеты в течение одного часа при комнатной температуре для окрашивания присутствующего вирусного белка. После инкубации трижды промойте клетки в 1% B-S-A-P-B-S и инкубируйте их с 100 мкл вторичных антител, конъюгированных с инфракрасным красителем, в разведении 1:200 в течение одного часа при комнатной температуре в темном месте. После окрашивания клеток промойте их трижды, как было описано ранее.

Затем поместите планшеты на стеклянную платформу для считывания инфракрасного сканера Licor Odyssey. В программном обеспечении Licor Odyssey выберите настройку для 96-луночного планшета. Определите лунки с холостым отрицательным контролем, после чего измерьте интенсивность флуоресценции по всему планшету.

Используйте инструмент создания фигур («auto shape tool»), чтобы выделить область интереса (ROI) в центре лунки теста. Используйте ROI из отрицательного контроля. Чтобы установить базовое значение флуоресценции для анализа, поместите два перекрестия, предусмотренных программным обеспечением Odyssey, внутри ROI для измерения интенсивности флуоресценции по всей лунке.

Затем просканируйте планшет, используя канал 780 нанометров для детектирования и 680 нанометров в качестве опорной длины волны. После активации команды считывания будут измерены интенсивности флуоресценции с равномерным интервалом в области интереса (ROI). Затем полученные точки данных будут интегрированы.

Множитель стандартного отклонения будет определять уровень сигнала над базовой линией, который будет включен в ROI; при расчетах обязательно выберите опцию интегрированной интенсивности, так как она представляет собой чистый объем пикселей для заданных областей независимо от их размера. Фоновая флуоресценция будет количественно определена по контрольным образцам с имитацией инфекции и будет использована для оценки интегрированной интенсивности в тестовых лунках. Инфракрасная флуоресценция из дубликатных лунок, содержащих серийные разведения титрованного вируса, используется для построения стандартной кривой.

Затем стандартную кривую можно использовать для определения титров вируса в жидкости БАЛ мышей, инфицированных вирусом. В данном эксперименте значительное увеличение вирусной нагрузки наблюдалось на второй и четвертый день. Как показано здесь, к 10-му дню после инфицирования вирус был элиминирован.

Титры вируса, измеренные с помощью данного анализа, хорошо коррелируют с потерей веса мышей после инфицирования. Этот метод также может быть применен к образцам, полученным от людей. Здесь представлено количественное определение вируса H1N1 из мазка из полости носа человека.

Предел обнаружения в данном случае составляет 10³ TCID (инфекционная доза для культур тканей). После просмотра этого видео у вас также появится четкое представление о том, как оценивать титр вируса гриппа с помощью анализа на основе инфракрасного красителя. Визуальная демонстрация данной методики имеет решающее значение, поскольку использование имиджера Core может быть затруднительным, и это поможет упростить и продемонстрировать наши методы количественного определения вирусных титров в 96- или 384-луночном планшете.

И наконец, не забывайте, что работа с вирусами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда использовать средства индивидуальной защиты.