Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Общая цель этой процедуры заключается в эффективном количественном определении титров вируса гриппа в дыхательных путях инфицированных мышей. Мышей сначала прививают интраназально вирусом гриппа в выбранное время. Точки после заражения.

М жертвуются и собирается бронхоальвеолярный лаваж или жидкость БАЛ. Далее жидкость BAL используется для инфицирования клеток MDCK. Затем инфицированные клетки могут быть окрашены на наличие вирусных белков с использованием специфических первичных антител, за которыми следуют инфракрасные конъюгированные вторичные антитела.

Инфракрасные сигналы считываются с помощью сканера Lycor Odyssey, а программное обеспечение Odyssey может быть использовано для определения вирусных титров. С помощью стандартной кривой можно получить количественное определение титров вируса. Основными преимуществами этого метода по сравнению с существующими методами являются точная количественная оценка титров вируса, воспроизводимость и небольшой объем, необходимый для выполнения этого анализа.

Применение этого метода может быть распространено на диагностику и терапию различных респираторных вирусных заболеваний, поскольку он может быть использован для количественной оценки титров вируса в клинических образцах после этой процедуры. Другой метод, такой как QPCR, может быть выполнен для ответа на дополнительные вопросы, такие как номер вирусной копии. При использовании этого метода важно не забывать проверять вирус стандартного контроля титра после этой разработки.

Этот метод открывает для исследователя в области вирусной логики путь к исследованию титра вируса или скручивания окрашивания вирусного белка в клинических образцах. Как только вы освоите эту технику, ее можно будет выполнить за 17 часов. Он проводил точно Интраназально заражал мышей 5 000 платформенных единиц или PFU PR восьми вирусов гриппа в 30 микролитрах стерильных PBS или только PBS в качестве отрицательного контроля для сбора жидкости BAL от усыпленных животных сначала, разрезал грудную полость и делал разрез в один сантиметр параллельно трахее, чтобы обнажить ее тонкими стерильными ножницами.

Сделайте небольшой разрез в трахее, введите в трахею 0,5 миллилитра 1% БСА, содержащего PBS, и аккуратно отсасывайте жидкость для промывания. Храните жидкости BAL при температуре минус 20 градусов по Цельсию для количественной оценки титров вирусов в жидкостях для промывания воды. Сначала культивируйте 5 миллионов клеток MDCK в 20 миллилитрах полного RPMI в колбе T 75 в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день, собирайте клетки и помещайте их в оптический 96-луночный планшет с плоским дном из расчета 10 000 клеток на лунку.

Затем инкубируйте планшет на ночь при температуре 37 градусов по Цельсию после инкубации. Аккуратно отсадите надосадочную жидкость и дважды промойте клетки полным, но не содержащим сыворотки DMEM, содержащим 0,2% BSA вместо FBS. После того, как клетки будут промыты, добавьте 50 микролитров жидкости BAL или 50 микролитров суспензии, содержащей известную концентрацию вируса, на лунку.

Затем добавьте 50 микролитров на лунку DMEM, среды, содержащей обработанный TPCK трипсин в концентрации 0,2 микрограмма на миллилитр для усиления прикрепления, проникновения и репликации вируса. Инкубируйте клетки в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию, чтобы позволить вирусу впитаться. Затем добавьте 100 микролитров FBS, содержащего полный RPMI, в каждую лунку, культивируя клетки в течение ночи, чтобы позволить инфекции распространиться после ночной инкубации.

Промойте клетки 100 микролитрами 1%B-S-A-P-B-S. После того, как клетки промыты, добавьте 100 микролитров на лунку 1% параформальдегида и инкубируйте пластины в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы зафиксировать клетки. Затем промойте 100 микролитров на лунку 1% B-S-A-P-B-S и инкубируйте клетки еще 30 минут для блокировки. После того, как клетки были заблокированы, добавьте 50 микролитров в лунку первичного противовирусного антитела М-2, разведенного в соотношении один к 1000, и инкубируйте планшеты в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы окрасить любой вирусный белок, присутствующий после инкубации, промойте клетки три раза в 1% B-S-A-P-B-S и инкубируйте их с 100 микролитрами на лунку конъюгированного инфракрасного красителя вторичного антитела в соотношении от одного до 200 в течение одного часа при комнатной температуре В темноте, как только клетки будут окрашены, промойте их три раза, как и раньше.

Затем расположите пластины на платформе стекла для чтения инфракрасного сканера Licor Odyssey. Выберите настройку планшета на 96 лунок на считывателе с помощью программного обеспечения Licor Odyssey. Определите пустые отрицательные контрольные лунки, затем количественно оцените флуоресценцию всей пластины.

Используйте инструмент «Автофигура», чтобы нарисовать область интереса или ROI в середине теста. Что ж, используйте ROI от отрицательного контроля. Чтобы установить базовое значение флуоресценции для анализа, затем введите два противоположных перекрестия, предоставленных программным обеспечением Odyssey, в ROI для измерения интенсивности флуоресценции в лунке.

Затем отсканируйте пластину, используя канал 780 нм для обнаружения и 680 нм в качестве опорной длины волны. После активации команды чтения будут измерены интенсивности флуоресценции с равномерными интервалами ROI. А затем собранные точки данных были интегрированы.

Множитель стандартного отклонения определит уровень сигнала над базовым уровнем, который включен в ROI; обязательно выберите опцию интегрированной интенсивности для расчетов, поскольку она представляет собой чистый объем пикселей для определенных областей независимо от размера. Фоновая флуоресценция будет количественно определена для имитации инфицированных контрольных элементов и будет использоваться для оценки интегральной интенсивности в испытательных скважинах. Инфракрасная флуоресценция из дублирующих лунок, содержащих серийные разведения титруемого вируса, используется для построения стандартной кривой.

Затем стандартная кривая может быть использована для определения титров жидкости BAL у инфицированных мышей. В этом эксперименте значительное увеличение вирусной нагрузки наблюдалось на второй и четвертый день. Постинфекционный вирус был ликвидирован к 10-му дню, как показано здесь.

Титры вируса, измеренные с помощью этого анализа, хорошо коррелируют с потерей веса мышей после инфекции. Этот метод также может быть применен к человеческим образцам. Здесь показано количественное определение вируса H one N one из мазка из носа человека.

Предел обнаружения здесь составляет от 10 до трети ТЦИД или инфекционной дозы культуры тканей. После просмотра этого видео вы также хорошо понимаете, как оценить титр вируса гриппа с помощью инфракрасного анализа на кристалле. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что использование корпоративного имидж-сканера может быть затруднено, и это поможет упростить и продемонстрировать наши методы количественного определения титров вируса в 96 или 384 луночном планшете.

И, наконец, не забывайте, что работа с вирусом может быть крайне опасной и при выполнении этой процедуры всегда следует брать с собой прекурсоры, такие как средства индивидуальной защиты.