MAME Модели 4D Онлайн-клеточного изображения опухоли: микроокружение взаимодействия, что воздействие злокачественной прогрессии

Общая цель данной процедуры заключается в создании трехмерных моделей совместного культивирования, называемых инженерией архитектуры и микроокружения молочной железы (MAM), для использования в режиме реального времени при визуализации взаимодействий живых клеток. Это достигается путем предварительного покрытия покровных стекол матриксом из коллагена I типа, гашенного флуоресцентным красителем DQ (DQ collagen one).

Затем следует этап с использованием гашенного DQ-коллагена I. Во-первых, на поверхность затвердевшего DQ-коллагена I — матрицы из коллагена I с иммобилизованными фибробластами — наносится реконструированный матрикс базальной мембраны. На третьем этапе поверх покровных стекол наносится суспензия эпителиальных клеток или опухолевых клеток, что позволяет клеткам прикрепиться к DQ-коллагену I и реконструированному матриксу базальной мембраны, после чего добавляется среда.

Наконец, для проведения 4D-визуализации используется конфокальная микроскопия, которая позволяет анализировать изображения живых маммоидных кокультивируемых систем в трех пространственных измерениях и во времени. В конечном итоге 4D-визуализация обеспечивает возможность наблюдения и анализа динамического взаимодействия между клетками опухоли молочной железы и другими клетками микроокружения опухоли, которые могут влиять на переход к инвазивному фенотипу. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как прижизненная визуализация (intra vital imaging), является то, что в нашей модели наблюдаются взаимодействия между клетками одного вида — то есть между клетками опухоли человека и ассоциированными с опухолью клетками человека, а не, например, между клетками опухоли человека и стромальными клетками мыши.

Как правило, лица, впервые осваивающие данный метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку сборка основных стержневых культур требует предварительного визуального ознакомления, а затем — определенного уровня навыков и практики для достижения успеха. Начните с размещения одной прямоугольной пластиковой крышки, стерилизованной спиртом. Вставьте ее в чашку Петри диаметром 35 мм или используйте чашку mu диаметром 35 мм от IBI tree.

Затем смешайте необходимое количество фибробластов с DQ-коллагеном. Далее, используя микропипетку на 100 µL, аккуратно нанесите и распределите 70 µL смеси фибробластов с DQ-коллагеном (один коллаген на одну матрицу) по всей поверхности покровного стекла и поместите чашку с культурой в увлажненный инкубатор при 37 °C без подачи CO2 на 30 минут. После затвердевания матриц оставьте их для уравновешивания на 10 минут в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.

Затем поместите чашку под вытяжной шкаф до достижения комнатной температуры. Нанесите 60 µL DQ collagen, four reconstituted basement membrane matrix поверх затвердевшего DQ collagen, one, collagen one matrix с внедренными фибробластами. Затем с помощью наконечника пипетки аккуратно и равномерно распределите DQ collagen four reconstituted basement membrane matrix, стараясь не повредить фибробласты в DQ collagen one, collagen one matrix.

Затем перенесите чашку и покровное стекло в инкубатор при 37 °C с 5% carbon dioxide на 10 минут, чтобы матрикс реконструированной базальной мембраны DQ collagen four затвердел; в это время обработайте клетки трипсином и подсчитайте их количество для совместного культивирования. Теперь нанесите 50 µL клеточной суспензии на покрытое покровное стекло и поместите чашку в инкубатор при 37 °C с 5% carbon dioxide на 40–60 минут, чтобы клетки прикрепились к матриксу реконструированной базальной мембраны DQ collagen four. После прикрепления клеток к матриксу добавьте в чашку диаметром 35 мм 2 mL культуральной среды, содержащей 2% реконструированной базальной мембраны.

Затем, перед проведением визуализации, промойте кокультуры раствором PBS и инкубируйте их с 5 µM CellTracker Orange в среде MEGM в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение 45 минут. После инкубации снова промойте кокультуры раствором PBS и инкубируйте их в предварительно нагретой среде MEGM в течение 30 минут в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Выполните визуализацию живых кокультур при малом увеличении (например, 10x с использованием объектива с иммерсией в воду на конфокальном микроскопе), фиксируя оптические срезы с интервалом 10 мкм по всей глубине структур.

Используйте оптические срезы для реконструкции изображений в 3D с помощью программного обеспечения Velocity или аналогичной программы. Создайте видеоролики 3D-реконструкций, чтобы можно было визуализировать структуры, межклеточные взаимодействия и взаимодействия с окружающим матриксом. На данной репрезентативной схеме совместного культивирования чашка для обработки IBI была сначала покрыта коллагеном, одна из которых содержала DQ-коллаген, а другая — фибробласты, показанные здесь пурпурным цветом.

Затем был добавлен второй слой реконструированной базальной мембраны, содержащий DQ коллаген IV. Далее поверх него, в культуре, на 2% реконструированной базальной мембраны, были высеяны опухолевые клетки (выделены красным).

Среда, обозначенная точками кремового цвета, добавлялась при каждой замене среды. Флуоресцентные продукты расщепления DQ collagen one и four представлены зеленым цветом. В течение 23 дней в этой репрезентативной кокультуре MCF 10 DCIS и WS 12 TI наблюдалась пролиферация клеток, показанная здесь и на следующих рисунках красным цветом, а также деградация DQ collagen four и one, показанная здесь и на следующих рисунках зеленым цветом, и коллагеновых матриксов, о чем свидетельствует уменьшение объема кокультур.

Те же живые кокультуры наблюдали в течение 23 дней, фиксируя изображения с помощью конфокальной микроскопии на 3-и, 16-и и 23-и дни кокультивирования. Взаимодействия в кокультурах Mame динамичны и могут меняться со временем. Например, как видно на этой 3D-модели кокультуры клеток mam на третий день, в данный момент клетки только начинают пролиферировать в матриксах, оставаясь при этом довольно стабильными, о чем свидетельствует отсутствие зелетой флуоресценции.

Однако к 16-му дню, по мере продолжения пролиферации клеток, они также начали разрушать структуру матрикса, что наблюдается здесь по продуктам расщепления DQ collagen один и четыре зеленого цвета, а также по активному разрушению матрикса клетками, при котором матрикс и клетки флуоресцируют совместно, что видно в желтом цвете. К 23-му дню почти половина матрикса была разрушена быстро пролиферирующими клетками по сравнению с 3-м днем, когда объем кокультуры составлял 110 000 µm³. В период с 16-го по 23-й день объем сократился всего до 46 250 µm³.

16 при совместном культивировании можно наблюдать протеолиз DQ-коллагена IV на поверхности клеток DCIS, отмеченных красным, и диффузный протеолиз DQ-коллагена I в областях рядом с фибробластами, отмеченными белым. Дифференциальное окрашивание, используемое в данной совместной культуре, также позволяет наблюдать за различными паттернами миграции и пролиферации двух типов клеток после их развития. Этот метод открыл исследователям в области рака молочной железы путь к изучению влияния макроокружения опухоли на прогрессирование рака, используя визуализацию живых клеток для анализа динамических взаимодействий между раковыми клетками и окружающими клетками стромы.