Подготовка индивидуальных Drosophila Яйцо палат для работы с изображениями Онлайн

Целью данного эксперимента является запись динамических процессов в живых U-сайтах дрозофилы. Для этого сначала выделяют неповрежденные яичники из сытых двухдневных самок мух. На втором этапе из яичников извлекают отдельные ареолы для визуализации яйцевых камер.

Затем, если они экспрессируют соответствующий флуоресцентный белок, отдельные яйцевые камеры можно визуализировать напрямую или подвергнуть дальнейшим манипуляциям, таким как микроинъекция флуоресцентных маркеров перед визуализацией. В конечном итоге, путем анализа видеопоследовательностей, можно выявить динамику взаимодействия внутриклеточных компонентов. Этот метод помог нам ответить на некоторые ключевые вопросы в области транспорта РНК и локального трансляционного синтеза.

Например, как в живом организме во времени и пространстве регулируется экспрессия белков, определяющих план строения тела? Как правило, новичкам в этом методе будет трудно, так как он требует значительной скорости и ловкости рук. Лучших результатов можно достичь при наличии достаточной практики.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как манипуляции с яйцевыми камерами трудно описать текстом, и они требуют от исследователя технического мастерства и уверенности в движениях. Начните выполнение данной процедуры с нанесения небольшой капли галоуглеродного масла на покровное стекло, после чего отложите его в сторону. Затем анестезируйте подготовленных мух углекислым газом.

С помощью острого тонкого пинцета захватите упитанную самку мухи в передней части брюшка. Не захватывайте насекомое в центре брюшка. Удерживайте самку примерно на расстоянии двух-трех сантиметров над подготовленным покровным стеклом.

С помощью второго пинцета удалите ткани на крайнем заднем конце самки. Обычно в это число входят ткани кишечника, которые следует извлечь чистым пинцетом. Осторожно помассируйте брюшко, продвигаясь от переднего к заднему концу, подобно тому, как выдавливают зубную пасту из тюбика.

Яичники выглядят как крупные непрозрачные структуры и будут прилипать к концу пинцета. Соберите яичники, касаясь ими гало-углеродного масла на предметном стекле. Затем повторите эту процедуру, пока не будет собрано от четырех до шести яичников.

Перед выделением антенн настройте источник света микроскопа таким образом, чтобы освещение падало на предметное стекло под небольшим углом, создавая контрастные тени на тканях. При диссекции мух крайне важно использовать подходящий инструментарий.

Используемый нами зонд не слишком острый, чтобы не повредить ткани, но достаточно тупой, чтобы мы могли захватить пинцет. Аналогично, пинцет не должен быть слишком острым, чтобы не повреждать ткани, но достаточно подходящим, чтобы мы могли манипулировать объектами, не сгибая инструмент. Также очень важно, чтобы инструменты были чистыми, поэтому мы регулярно очищаем их в ходе процедуры, используя закрытый зажим.

Разделите два яичника, удалив соединительную ткань на заднем конце. На заднем конце расположены наиболее зрелые яйцевые камеры. Расположите яичник горизонтально так, чтобы самые молодые яйцевые камеры были обращены к вашей доминирующей руке.

Затем осторожно захватите задний конец за оставшуюся соединительную ткань и с помощью диссекционного зонда или вольфрамовой иглы аккуратно выделите отдельные яичники. Яйцекамеры от стадии Jamar до 10-й стадии будут отделяться друг от друга, в то время как более зрелые яйцекамеры останутся прикрепленными к яичнику. С помощью зонда осторожно переместите 15–25 отделенных яичников в центр капли масла. Если требуется препарировать более одного яичника, возьмите его от другой мухи.

Удалите излишки ткани яичников и работайте быстро, так как циты начнут проявлять фенотипические изменения из-за стресса. Через 40 минут после выделения из яичника извлеките излишки ткани из масла. Используя чистые инструменты для инъекции цитов средней стадии, расположите ареолы перпендикулярно длинной оси покровного стекла. Для изоляции яйцевых камер поздней стадии.

При захвате задней части яичника, как было описано ранее, требуется иной метод. Введите диссекционный зонд в задний конец яичника рядом с пинцетом. Чтобы избежать повреждения яйцевых камер, вводите зонд между камерами с яйцами на поздних стадиях развития.

Проведите диссекционную иглу через яичник до тех пор, пока она не выйдет в области яйцевых камер на ранней стадии развития. При правильном выполнении зонд удалит соединительную ткань, удерживающую овариолы и яйцевые камеры на поздней стадии развития. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока овариолы не распределятся по покровному стеклу.

Данный этап считается завершенным, когда яйцевые камеры больше не расположены друг над другом. С помощью диссекционного зонда разделите яйцевые камеры на поздних стадиях развития, чтобы облегчить визуализацию и позиционирование камер стадии 14. Для захвата их дорсальных придатков используйте пинцет.

Подготовьте растворы для инъекций, подвергнув их кратковременному высокоскоростному центрифугированию. Это позволит осадить любые твердые частицы, которые могли бы заблокировать инъекционную иглу. Затем с помощью загрузочного наконечника наполните инъекционную иглу и осторожно закрепите заполненную иглу в инжекторе.

Теперь поместите небольшой кусочек стекла рядом с образцами и установите предметное стекло на предметный столик микроскопа. Стекло будет служить перегородкой для разрыва или фиксации. Извлеките иглу.

Подготовьте микроскоп и инъекционный аппарат к проведению эксперимента. Соблюдайте осторожность, чтобы не сломать кончик иглы. По возможности используйте автоматизированный предметный столик с функцией перемещения по заданным точкам, чтобы отметить все клетки восьмой и девятой стадий для проведения инъекций.

Теперь опустите инъекционную иглу до соприкосновения с маслом. Выберите первую точку из списка отмеченных точек и сфокусируйтесь на ците. Вручную опускайте иглу до тех пор, пока она не окажется в той же плоскости фокусировки, что и цит.

С помощью органов управления манипулятором переместите кончик инъекционной иглы до тех пор, пока она не окажется внутри участка U. Быстрый прокол часто оказывается более эффективным, чем медленное введение. После попадания в цель введите из иглы небольшой объем вещества и визуально оцените полученный эффект.

Требуется повторение. При успешной инъекции цитоплазма внутри клетки будет вытеснена. Точное количество введенной жидкости трудно количественно определить.

Для увеличения объема инъекции отрегулируйте давление или продолжительность импульса инъекции. Слегка отломите кончик иглы, чтобы немного увеличить отверстие, или просто используйте несколько импульсов инъекции перед выбором следующего mark.Cyte. Поднимите инъекционную иглу в масле достаточно высоко, чтобы она не задевала другие циты.

Слишком многократные проколы или длительное удерживание иглы внутри цисты приводят к серьезному повреждению яйцевой камеры. Поэтому действуйте быстро. Инъекция должна занять менее 10 секунд.

Если была допущена ошибка, перейдите к следующей метке участка. Не тратьте время на поврежденные участки. В случае засорения иглы переместите её в осколок стекла.

Расположив стекло и иглу в одной фокальной плоскости, осторожно введите иглу в стекло. Убедитесь, что игла не засорена, нажав кнопку инъекции и проверив, выходит ли жидкость из кончика иглы. После завершения инъекций во все участки УЗИ вручную извлеките иглу из масла и отведите ее из зоны прохождения луча микроскопа.

Убедитесь, что образец расположен безопасным образом, чтобы избежать повреждения глаз; свет должен быть выключен. Для обеспечения скорости флуоресцентной визуализации крайне важно соблюдать временные интервалы. Если между изоляцией яйцевой камеры и инъекцией цитов прошло один час или более, инъекции цитов будет сложно выполнить, и они проявят фенотипические изменения, связанные со стрессом.

Аналогичные проблемы могут возникнуть при грубом обращении с клеткой или введении избыточных объемов. Камеры яиц, экспрессирующие трансгенные флуоресцентные белки, можно визуализировать без необходимости инъекции. Маркировка эндогенной РНК с помощью MS2 может быть визуализирована с хорошими результатами при использовании процедур изоляции тканей с применением полного метода синтеза in vitro.

РНК Alexa, 5 46 kin была введена в яйцевую камеру ME 31 BGFP; РНК локализовалась в дорсальной передней части циста и образовала вокруг ядра колпачок. После освоения эта методика может быть выполнена примерно за 10 минут — от момента диссекции до начала визуализации. При выполнении данной процедуры бережно относитесь к ткани, работая быстро, но аккуратно. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как регистрировать динамические процессы в живых цистах Drosophila.