Полированные и железобетона тоньше череп-Window для долгосрочных изображений из мозга мыши
7 марта 2012 г.
Представлен метод формирования изображения окна в мышь череп, который охватывает миллиметров и стабилен в течение месяца без воспаление головного мозга. Этот метод хорошо подходит для продольного исследования кровотока, клеточной динамики, и клетка / сосудистые структуры с использованием двух-фотонной микроскопии.
Общая цель данной процедуры заключается в создании стабильного тонкого костного окна в черепе мыши над корой головного мозга для проведения повторных сеансов визуализации без нарушения внутричерепной среды. Для этого сначала устанавливается головной фиксатор, который обеспечит стабильное положение головы под аппаратом для визуализации. Затем в области над дорсальной поверхностью мозга аккуратно истончают кость черепа и полируют поверхность мелкозернистым абразивом.
Затем закрепите окно, нанеся небольшое количество цианоакрилатного клея и накрыв его покровным стеклом. Заключительным этапом является подготовка животного к визуализации с помощью двухфотонного микроскопа. В конечном итоге двухфотонная микроскопия in vivo используется для визуализации тонких структур, таких как артериолы, вены, капилляры и дендриты нейронов, которые можно наблюдать на глубине до 250 микрометров в коре головного мозга на протяжении нескольких недель.
Основным преимуществом данной методики создания краниального окна является то, что часть черепа, перекрывающая кору, остается неповрежденной. Сначала мы истончаем череп до достижения оптической прозрачности, а затем укрепляем его с помощью цианоакрилатного клея и покровного стекла. Этот метод может быть полезен для изучения различных линий флуоресцентных трансгенных мышей в состоянии наркоза или в состоянии OIC.
Для начала данной процедуры проавтоклавируйте необходимые хирургические инструменты, проведите анестезию мыши в возрасте примерно от трех до шести недель согласно методам, описанным в прилагаемой рукописи. Проверьте рефлекс, сжав пальцы лапы, чтобы убедиться, что мышь находится в состоянии хирургического наркоза. Затем зафиксируйте мышь в стереотаксической раме.
Поддерживайте температуру тела мыши на уровне 37 °C, используя ректальный датчик с обратной связью и грелку. Нанесите на глаза офтальмологическую мазь для предотвращения пересыхания.
Затем сбрейте шерсть с головы с помощью маленькой электрической бритвы. После этого очистите кожу головы раствором Betadine, а затем протрите ее 70% изопропиловым спиртом. Затем под микроскопом нагрейте аликвоту стерильной искусственной спинномозговой жидкости до 37 °C.
С помощью хирургических ножниц удалите кожу со всей дорсальной поверхности черепа. Обрежьте кожу латерально до краев височных мышц с обеих сторон черепа и кзади от мышц шеи. Затем с помощью скальпеля удалите тонкий слой надкостницы с поверхности черепа.
Затем высушите и очистите череп. После этого нанесите на поверхность черепа тонкий слой цианоакрилатного клея. Дайте клею полностью высохнуть.
Этот слой клея необходим для надлежащей адгезии стоматологического цемента. На последующих этапах подготовки к визуализации в состоянии бодрствования просверлите отверстия и введите два самонарезающих винта размера 0 0 0 в поверхность противоположной стороны черепа.
Затем закрепите на черепе жесткий специально изготовленный коннектор с двумя точками крепления. Это значительно сокращает число степеней свободы и упрощает поиск того же поля визуализации при проведении лонгитюдных исследований. Широкая поперечная перекладина также обеспечивает достаточное пространство для размещения электродов и стимуляции вибрации.
Затем покройте всю поверхность черепа, за исключением области будущего окна, слоем стоматологического цемента, убедившись, что все открытые края кожи также закрыты цементом. Перед истончением кости черепа убедитесь, что боры острые, и избегайте их повторного использования. С помощью стоматологического бормашины на низких оборотах истончите участок размером 2 мм на 2 мм над соматосенсорной корой, используя бор диаметром 0,5 мм.
Затем в течение нескольких секунд истончайте поверхность сухого черепа, периодически смачивая его CSF для предотвращения перегрева. Продолжайте истончать кость. Далее переключите бормашину на более низкую скорость и снимайте слой с поверхности черепа легкими касаниями.
Бор должен приближаться к поверхности под углом примерно 30 градусов по отношению к вертикали. Продолжайте истончать кость, проходя через сосудистый слой до второго слоя кости, над поверхностью мозга.
Держите сверло, совершая небольшие контролируемые движения, и прикладывайте усилие только в латеральном направлении. Когда толщина кости составит около 50 microns, сосуды кожи должны стать отчетливо видны сквозь влажную кость. На этой глубине в течение нескольких секунд в кости станут заметны маленькие белые пятна.
Сразу после увлажнения сухой поверхности черепа конечная толщина кости должна составлять примерно 10–15 microns. Когда кость станет достаточно тонкой, маленькие белые пятна в кости перестанут быть заметными при увлажнении сухой поверхности черепа. Теперь отполируйте окно с помощью порошка оксида олова.
Возьмите небольшую щепотку порошка, размер которой составляет примерно одну четверть площади окна, и приготовьте суспензию порошка с ЦСЖ, используя заранее подготовленное сверло с силиконовым наконечником. Полируйте поверхность в течение 10 минут, тщательно промойте окно от порошка оксида олова и высушите кость. Этот процесс поможет сгладить любые шероховатости, оставшиеся после сверления в ходе процедуры истончения.
Затем вырежьте несколько квадратных фрагментов покровного стекла номер ноль, размер которых будет немного меньше размера окна. С помощью резака аккуратно проведите по стеклу разделительные горизонтальные и вертикальные линии. Слегка надавите ровным краем инструмента, не разбивая стекло.
Затем поместите покровное стекло в чашку Петри. Разделите стеклянные фрагменты, постучав чашкой о край стола. После этого с помощью деревянного конца сломанного аппликатора с ватным наконечником нанесите небольшое количество клея Sano ACRL на окно.
Быстро поместите предварительно вырезанный кусочек покровного стекла поверх клея. Не допускайте образования пузырьков воздуха под покровным стеклом после того, как клей полностью высохнет в течение 15 минут. Удалите излишки цианоакрилатного клея с верхней поверхности покровного стекла с помощью лезвия скальпеля.
Герметизируйте края окна стоматологическим цементом. Затем сформируйте слегка приподнятую лунку для удержания воды, которая потребуется для иммерсионного объектива в конце процедуры. Поместите животное в теплую клетку до полного восстановления после анестезии.
На данном этапе зафиксируйте животное на оптическом столе для проведения визуализации, используя раму в качестве опоры для головы. Наша отдельная пластина позволяет перемещать животное и все устройства физиологического мониторинга, собранные в единый блок, между местом проведения операции и установкой для двухфотонной визуализации. Если требуется визуализация кровотока, введите 0.05 milliliters 5% флуоресцентного декстрана через инфраорбитальную вену для маркировки сыворотки крови.
Данную процедуру необходимо проводить под общим наркозом; краситель обычно остается в кровотоке в течение нескольких часов. Для поддержания жидкостного баланса и энергетических потребностей организма каждые два часа вводите раствор Рингера-лактата внутрибрюшинно в объеме 3 µL на грамм массы тела. Для пробуждения мыши прекратите подачу изофлурана.
Через час после пробуждения мышь готова к визуализации. Закройте клетку над микроскопом, чтобы предотвратить попадание постороннего света. Показано. Здесь представлен пример сосудов коры бедра мыши YFP, помеченных путем внутривенного введения конъюгата декстрана с Texas red; сосуды твердой мозговой оболочки часто видны чуть выше поверхности коры в dura mater.
Крупные поверхностные артерии и вены расположены на поверхности коры. Проникающие сосуды отходят от этой поверхностной сети и погружаются в кору, где они разветвляются, образуя плотную капиллярную сеть, которая питает ткани коры. В данном видео продемонстрировано состояние сосудов на поверхности коры у бодрствующей мыши.
Спонтанные колебания диаметра артерии могут наблюдаться, когда животное находится в состоянии спокойного покоя. Данный метод может быть полезен для изучения широкого спектра флуоресцентных животных в состоянии наркоза или в бодрствовании.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод создания стабильного имплантационного окна в черепе мыши, позволяющий проводить долгосрочную визуализацию без развития воспаления мозга. Данная методика особенно полезна для лонгитюдных исследований кровотока и клеточной динамики.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Методы визуализации
- Клеточная динамика
Теоретическая часть
- Стабильные окна визуализации имеют решающее значение для исследований in vivo.
- Традиционные методы могут нарушать внутричерепную среду.
- Двухфотонная микроскопия позволяет осуществлять глубокую визуализацию структур мозга.
- Лонгитюдные исследования требуют стабильных условий в течение длительного времени.
Цель исследования
- Разработать метод стабильной визуализации коры головного мозга мыши.
- Обеспечить возможность повторной визуализации без возникновения воспаления.
- Улучшить изучение кровотока и клеточных структур.
Используемые методы
- Установка стабильного головного крепления для визуализации.
- Истончение костей черепа над дорсальной поверхностью головного мозга.
- Полировка поверхности черепа для обеспечения четкости изображения.
- Укрепление окна с помощью цианоакрилатного клея и покровного стекла.
Основные результаты
- Успешное создание стабильного окна для визуализации.
- Возможность визуализации структур на глубине до 250 мкм.
- Наблюдаемая долгосрочная стабильность в течение нескольких недель.
- Эффективная визуализация артериальных и капиллярных структур.
Выводы
- Данный метод позволяет проводить неинвазивную визуализацию коры головного мозга мыши.
- Он обеспечивает возможность детального изучения клеточной динамики и кровотока.
- Эта методика может способствовать развитию исследований в области нейронаук.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Продольное прижизненное получение изображений функций коры головного мозга требует стабильного оптического доступа без нарушения внутричерепной среды, что является критически важным условием для валидации мишеней в доклинических нейробиологических исследованиях. Окно из полированного и усиленного истонченного черепа (PoRTS) позволяет проводить повторные сеансы визуализации на протяжении нескольких месяцев с минимальным воспалением, что способствует механистическому снижению рисков при проверке терапевтических гипотез в системах, релевантных для конкретных заболеваний. Данный подход повышает прогностическую точность на ранних этапах поиска за счет обеспечения количественных и воспроизводимых показателей клеточной и сосудистой динамики в препаратах как под наркозом, так и в состоянии бодрствования.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с помощью лонгитюдной визуализации сосудов коры и нейронных структур без вскрытия черепа.
- Практическая ценность: снижает биологическую вариабельность за счет сохранения целостности внутричерепной среды в ходе повторяющихся сессий.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени, позволяя визуализировать эффекты препаратов на кровоток и клеточную функцию в течение длительных периодов времени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает подготовку валидированных биологических систем для последующей стандартизации анализа путем создания стабильной платформы для визуализации.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость за счет единообразной подготовки окон и сохранения оптической прозрачности в течение нескольких недель.
- Масштабируемость: Позволяет повторно использовать платформу для различных флуоресцентных трансгенных моделей при оценке соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет релевантность модели заболевания, обеспечивая возможность визуализации функций коры как в состоянии наркоза, так и в состоянии бодрствования.
- Практическая ценность: Способствует согласованию трансляционных биомаркеров за счет лонгитюдного отслеживания сосудистых и клеточных ответов.
- Снижение рисков: Позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении исследования с учетом рисков за счет уменьшения влияния смешивающих переменных, вызванных хирургическим вмешательством.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Окно PoRTS интегрируется в континуум открытий — от валидации мишени до доклинических исследований, обеспечивая непрерывный мониторинг биологических ответов без нарушения условий окружающей среды.
- Открытия в биологии: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов посредством многократной визуализации корковых структур с течением времени.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного, воспроизводимого приготовления окна с количественным проникновением вглубь до 250 μm.
- Аналитика: предоставляет измеряемые выходные данные, такие как осцилляции диаметра сосудов и динамика капиллярной сети, для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные открытия с доклинической преемственностью, позволяя проводить визуализацию в состоянии бодрствования, что лучше отражает физиологические реакции.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемая методика в различных исследованиях, снижая необходимость в повторном хирургическом приготовлении.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышение достоверности прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности и использования стабильной лонгитюдной визуализации.
- Операционная ценность: стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость в различных лабораториях и модельных системах.
- Стратегическая ценность: оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологических рисков на поздних этапах, связанных с интракраниальным вмешательством.
- Влияние на портфель: приоритизация с учетом рисков на основе лонгитюдных функциональных показателей, а не терминальных конечных точек.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрохирургических методик и подготовки краниального окна.
- Необходимы прецизионные инструменты, включая стоматологические боры, полирующие средства и системы двухфотонной микроскопии.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения единообразного проведения протоколов истончения и укрепления черепа.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных линий мышей и трансгенных моделей для достижения оптимальной оптической прозрачности.
- Ограничено необходимостью периодического технического обслуживания для предотвращения отслоения покровного стекла или деградации клея при длительных исследованиях.
