Хроматин иммунопреципитации (чип) использование Drosophila Ткани

Данная процедура позволяет получить данные иммунопреципитации хроматина из препарированных тканей мухи, чтобы точно отразить состояние хроматина in vivo в тканях Drosophila. В данном случае сотни семенников собирают путем ручного препарирования. Анализы по иммунопреципитации хроматина проводятся с использованием антител к интересующему белку.

Последующий количественный анализ методом ОТ-ПЦР для определения степени обогащения специфического геномного региона в очищенной ДНК с чипа. В качестве альтернативы, высокопроизводительное секвенирование образца с чипа позволяет получить профиль по всему геному. В конечном итоге анализ с помощью чипов препарированной ткани дает представление о состоянии хроматина в клетках в их физиологических условиях.

Данный протокол оптимизирован для анализа тканей, выделенных непосредственно из организма. Чтобы получить данные о состояниях хроматина и эпигенетическую информацию в реальных физиологических условиях, мы продемонстрируем использование метода ChIP на Drosophila для изучения состояния хроматина. Этот протокол может быть применен и к другим организмам, таким как мышь или данио-рерио.

Визуальная демонстрация данного протокола имеет решающее значение для получения ДНК надлежащего качества и в достаточном количестве для использования в микрочипах или при создании библиотек секвенирования для высокопроизводительного секвенирования. Сначала препарируйте интересующую ткань — в данном случае около 200 пар семенников дрозофилы — в холодном PBS, содержащем ингибитор протеаз и 100 µg/mL PMSF. После двукратного промывания ткани ресуспендируйте их в 200 µL того же раствора PBS с ингибиторами.

Затем зафиксируйте образец, добавив 5.5 µL подогретого 37% формальдегида. Инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут. Охладите ткань на льду, перемешивая на вортексе каждые пять минут.

Дважды промойте 450 мкл PBS с ингибиторами. Храните образцы при температуре -20 °C. Объедините 200 образцов яичек oph в пробирке Eppendorf объемом 1,75 мл.

Отожмите буфер и повторно суспендируйте образцы в 200 µL лизисного буфера. Полностью гомогенизируйте ткань с помощью голубого гомогенизатора, убедившись в отсутствии агрегатов, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.

Затем фрагментируйте образец с помощью микрочипового соната, выдержите на льду в течение 50 секунд. Повторите процедуру четыре-пять раз для получения оптимального размера фрагментов для ChIP-анализа. Затем разбавьте пробу 1,8 миллилитрами риппер-буфера для приготовления стокового раствора экстракта хроматина. Для успешного проведения ChIP-анализа крайне важно эмпирически определить размер фрагментов ДНК.

Для перехода к эксперименту на чипе необходимо провести гель-электрофорез. Из контрольного образца ввода отберите 50 µL. Добавьте 2 µL 5 M NaCl и инкубируйте при 65 °C в течение ночи.

Для предотвращения повторного сшивания переходите к конъюгации антитела с белком. Поместите бусины с белком A в микроцентрифужную пробирку Fendor объемом 1,5 мл. Добавьте 40 µL бусин с белком A и 600 µL PBS, затем перемешивайте на ротере при 4 °C в течение двух минут.

Затем поместите гранулы в магнит и удалите супернатант. Теперь добавьте 100 µL PBS, а также интересующие антитела. Инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа.

После сбора магнитных частиц с помощью магнита добавьте 1 мл экстракта хроматина ткани. Инкубируйте при 4 °C в течение ночи при перемешивании. Затем поместите образец ChIP на магнит и удалите супернатант.

Промойте собранные гранулы один миллилитр буфера при температуре 4 °C, повторяя процедуру 10 минут для каждой промывки, затем ресуспендируйте гранулы в 100 µL ТЕ-буфера. Для разрыва поперечных связей в комплексах белок-ДНК добавьте 3 µL 10% SDS и 5 µL протеиназы K в концентрации 20 mg/mL. Инкубируйте при температуре 65 °C в течение ночи.

Осадите гранулы с помощью магнита. Перенесите супернатант, содержащий ДНК, в новую пробирку. Промойте гранулы один раз и объедините супернатанты, содержащие нуклеиновые кислоты.

Затем очистите ДНК с помощью фенол-хлороформной экстракции и перенесите верхний водный слой в новую пробирку. Осадите ДНК, добавив линейный акриламид или гликоген в концентрации 20 µg/mL, 20 µL 3 M ацетата натрия и 500 µL 100% Ethanol.

Тщательно перемешайте и инкубируйте при температуре -80 °C в течение 10 минут. Осадите ДНК центрифугированием. Удалите супернатант и после высушивания на воздухе один раз промойте осадок 300 µL 70% этанола.

Ресуспендируйте осадки ДНК в 50 µL ТЕ-буфера. Храните образцы фрагментированной ДНК при температуре -20 °C. Подготовьте серию разведений геномной ДНК для построения стандартной кривой.

В 96-луночном планшете, используя в качестве шаблонов разведенный геномный ДНК-контроль ввода или фрагментированную ДНК, подготовьте QPCR-реакцию объемом 20 µL в дубликатах; центрифугируйте 96-луночный планшет в мини-центрифуге для планшетов. Проведите анализ планшета с образцами в системе ПЦР в реальном времени для подтверждения данных. Сначала убедитесь в наличии одного пика на графике термической диссоциации, что указывает на образование одного ампликона в результате ПЦР.

Затем постройте стандартную кривую. Используя данные серии разведений геномной ДНК, рассчитайте формулу, позволяющую определить количество ДНК в зависимости от порогового цикла Ct. Также определите линейную фазу экспоненциального усиления ПЦР для каждого набора праймеров.

Если значения CT образцов ДНК с чипа и контрольных образцов input находятся в линейном диапазоне значений CT, рассчитайте коэффициент обогащения ДНК с чипа относительно input. Разбавьте и достройте концы 0,1–5 мкг ДНК с чипа в реакциях объемом 50 µL, содержащих T4 ДНК-полимеразу и T4 полинуклеотидкиназу. Инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре согласно инструкциям производителя.

Затем очистите ДНК с помощью набора для очистки продуктов реакции MinLu. Продолжите работу, добавляя навесы на 3'-концы с использованием ДНК-полимеразы, одного большого фрагмента CLA NOW и dATP; инкубируйте смесь в течение 30 минут при 37 °C. Снова пропустите реакционную смесь через спин-колонку для очистки и концентрирования ДНК.

Переходите к лигированию с адаптерным олигонуклеотидом. Используйте смесь от Illumina с T four DNA Ligase, инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Затем очистите образец с помощью набора MinLu reaction cleanup kit.

Элюируйте ДНК в 20 µL. Затем разделяйте образец ДНК методом электрофореза с использованием аппарата egel. Вырежьте из геля полосу в диапазоне от 200 до 400 пар оснований и очистите ее с помощью набора для экстракции из геля KYOGEN.

Теперь амплифицируйте библиотеку, используя праймеры для двухстороннего чтения, ферменты fusion HF и pH от Illumina, в течение 20 циклов ПЦР. Затем на стандартном 2% AOSE-геле выделите фрагменты ДНК размером от 200 до 400 пар оснований для высокопроизводительного секвенирования в программе Ellen. Выровняйте все риды по геному drosophila, допуская до двух несовпадений с референсной последовательностью.

Для последующего анализа оставьте уникально картированные прочтения в случае наличия нескольких идентичных прочтений. Сохраните до трех копий, чтобы снизить вероятность возникновения систематических ошибок, связанных с ПЦР-амплификацией. Затем используйте Python-скрипт для преобразования выходных данных конвейера GA в файлы данных, расширяемые для браузера.

Установите размер окна в 4 пары оснований и размер фрагмента ДНК в 160 пар оснований. Классифицируйте гены дрозофилы на молчащие и экспрессируемые по значению RPKM. Присвойте цифровой номер генам, значение RPKM которых равно нулю.

Классифицируйте гены с RPKM более одного как «молчащую группу» и «экспрессируемую группу», которая в свою очередь делится на три подгруппы с низким, умеренным и высоким уровнями экспрессии. Наконец, сравните уровни модификации гистонов и экспрессии генов с помощью скрипта на языке Python, ранее описанного в работе basal 2007 «the bag of marbles». В семенниках мутантов наблюдается нарушение перехода от пролиферирующих сперматогоний к дифференцирующимся сперматоцитам.

В данном эксперименте по чип-кПЦР используются семенники BAM в качестве источника недифференцированных половых клеток для анализа состояния хроматина ключевых генов, необходимых для дифференцировки сперматозоидов. Определяется степень обогащения гистоновыми модификациями H3K27me3 или H3K4me3 у дифференцировочных генов путем нормализации по конститутивно экспрессируемому гену цикла. Гены дифференцировки, такие как male-specific transcription factor 87 (Don Juan) и fuzzy onion, которые не экспрессируются в семенниках BAM, характеризуются высоким уровнем репрессивной модификации гистона H3K27me3.

Кроме того, в них отсутствует активный гистон. Три, лизин 4 метил 3 модификация гистона. Хроматинную сигнатуру мы называем моновалентной в противовес валентности, характеризующейся наличием как гистона 3 лизин 4 метил 3, так и гистона 3.

Обогащение H3K27me3 в генах дифференцировки эмбриональных стволовых клеток. Данные ChIP-seq с использованием одного и того же набора антител. Подтверждение результатов ChIP-qPCR, представленных на рисунке 1A: геномные области всех трех исследованных генов терминальной дифференцировки сильно обогащены H3K27me3, но не H3K4me3.

Напротив, конститутивно экспрессируемый циклин старения характеризуется высоким уровнем H3K4me3, но низким уровнем H3K27me3 вблизи сайта начала транскрипции. На данном рисунке представлены данные ChIP-seq по двум модификациям гистонов вблизи сайтов начала транскрипции четырех классов дифференциально экспрессируемых генов. H3K27me3 обогащен ниже сайтов начала транскрипции, что обратно коррелирует с уровнем экспрессии генов.

Неактивные гены характеризуются наиболее высоким уровнем метилирования гистона H3 по лизину 27 (H3K27me3), в то время как высокоэкспрессируемые гены не обнаруживают связывания H3K27me3, что согласуется с репрессивной ролью H3K27me3 в экспрессии генов. Напротив, обогащение модификацией H3K4me3 (метилирование гистона H3 по лизину 4) в области сайтов начала транскрипции демонстрировало противоположную корреляцию с уровнем экспрессии генов, что соответствует активной роли H3K4me3 в экспрессии генов.

После освоения эта методика может быть выполнена надлежащим образом за два-три дня. Не забывайте соблюдать меры предосторожности при использовании фенола, хлороформа и формальдегида. Мы надеемся, что данный протокол дал вам достаточное понимание использования иммунопреципитации хроматина для анализа ландшафта хроматина в тканях in vivo.