Радиоактивный На месте Гибридизации для обнаружения разнообразных шаблонов экспрессии генов в ткани

Общая цель следующего эксперимента заключается в выявлении областей экспрессии конкретного гена, а также в характеристике времени и уровней этой экспрессии для более глубокого понимания функций гена. Это достигается путем быстрого сбора и подготовки ткани, используемой в данной процедуре, для сохранения ее целостности. На втором этапе ткань подвергается обработке для снижения фонового связывания рибозондов.

Затем проводят гибридизацию рибозондов с тканью и визуализируют связывание RIBA-зонда. С помощью рентгеновской пленки или светочувствительной эмульсии получают результаты, которые позволяют определить локализацию и уровень экспрессии генов на основе рентгеновских снимков, а также анализа методом темнопольной и светлой микроскопии. При использовании программного обеспечения Image J существует несколько критических этапов, требующих тщательного выполнения, на которых часто допускаются ошибки; одним из таких этапов является предотвращение появления фонового сигнала.

Существует ряд факторов, которые могут привести к появлению фонового сигнала, таких как плотная фиксация или гибридизация при неправильной температуре. Другим фактором является контаминация РНК, которая приведет к деградации вашего РНК-зонда. Поэтому необходимо строго соблюдать условия отсутствия РНКаз.

В-третьих, при погружении предметных стекол в эмульсию необходимо убедиться в отсутствии утечек света в темной комнате или засвечивания эмульсии на всех этапах этого процесса, который может длиться три недели. Эту методику продемонстрирует Хун Чэнь, постдок в моей лаборатории. После извлечения свежего мозга и промывки в 1× PBS зафиксируйте мозг в среде OCT tissue tech, погрузив его в форму со средой при комнатной температуре.

Убедитесь, что мозг ориентирован соответствующим образом для последующего секционирования. Затем, распылив этанол на сухой лед, заморозьте ткань, поместив блок в смесь этанола и сухого льда. Осторожно, чтобы этанол не попал внутрь блока, нарежьте замороженную ткань на срезы толщиной от 10 до 12 микрон с помощью криостата и зафиксируйте их на предметных стеклах Super Plus для тканей мозга и эмбриональных тканей.

Оптимальная температура среза находится в диапазоне от -18 °C до -20 °C. Храните срезы в лотке для слайдов при температуре -80 °C. Переносите слайды из хранилища при -80 °C в металлический штатив на сухом льду.

Затем, работая в сертифицированном вытяжном шкафу, поместите кассету в раствор 4% параформальдегида, предварительно нагретый до температуры на 3–5 °C выше комнатной. Инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. После инкубации извлеките кассету из параформальдегида и промойте предметные стекла, 15 раз погрузив кассету в PBS. Повторите этот этап промывки дважды, каждый раз используя свежий раствор PBS.

Затем погрузите предметные стекла в свежеприготовленный буфер для ацетилирования на 10 минут, чтобы снизить неспецифическое связывание зонда RIBA. После этого промойте стекла, как и прежде, но в этот раз в качестве промывочного раствора используйте 2-кратный SSPE. Обезводьте ткань, пропуская ее через серию растворов этанола с концентрацией 70, 95 и 100% по две минуты в каждом растворе.

Затем высушите предметные стекла в вытяжном шкафу в течение не менее 10–15 минут. После синтеза зонда RIBA, согласно инструкциям в письменном протоколе, рассчитайте необходимый объем зонда RIBA и раствора для гибридизации для всех предметных стекол. Предварительно прогрейте смесь для гибридизации с рибозондом при 65 °C в течение пяти минут.

Для денатурации Ribo-зонда пипеткой нанесите 100 µL гибридизационного раствора Ribo-зонда, распределив его по всей площади покровного стекла. Затем с помощью второго покровного стекла равномерно распределите раствор по ткани и покровному стеклу. Поместите предметное стекло горизонтально в металлическую стойку лицевой стороной вверх; когда все стекла будут подготовлены, медленно погрузите стойку в масляную баню при температуре 65 °C минимум на четыре часа и максимум на 16 часов.

Масло создает герметичное уплотнение вокруг покровных стекол после инкубации; удалите излишки масла с металлической кассеты со стеклами. Затем поместите кассету в стеклянный или металлический лоток с хлороформом в вытяжном шкафу. Повторите промывку во втором лотке со свежим хлороформом.

Затем погрузите кассету в раствор 0,1% β-меркаптоэтанола в 2× SSPE для ослабления сцепления покровных стекол и растворения излишков гибридизационного раствора. После этого перенесите стекла во второй раствор свежего 0,1% β-меркаптоэтанола в 2× SSPE. Переложите стекла без покровных стекол в новую кассету в кювете с 0,1% β-меркаптоэтанолом в 2× SSPE и инкубируйте в этом растворе в течение одного часа при комнатной температуре для удаления избытка несвязанного РНК-зонда.

Затем перенесите кассету со стеклами в предварительно нагретый до 65 °C раствор 2× SSPE с добавлением 50% формида, содержащий бета-меркаптоэтанол и этанол до конечной концентрации 0,1%, и инкубируйте при 65 °C в течение одного часа. После инкубации утилизируйте этот и все предыдущие водные промывочные растворы, а также покровные стекла как радиоактивные отходы. Затем дважды промойте стекла в предварительно нагретом до 65 °C растворе 0,1× SSPE по 30 минут за каждую промывку.

Затем обезводьте ткань, пропуская её через серию растворов этанола с концентрацией 70%, 95% и 100% по две минуты в каждом растворе. В завершение высушите предметные стекла в вытяжном шкафу в течение не менее 30 минут. Сначала необходимо определить, присутствует ли в ткани радиоактивный сигнал.

Поместите высушенные предметные стекла в кассету для пленки; работая в темной комнате при безопасном освещении, наложите рентгеновскую пленку на стекла. Убедитесь, что стекла обращены к эмульсионному слою пленки, после чего закройте кассету. Экспонируйте стекла на пленке от одного до семи дней, в зависимости от ожидаемого количества транскриптов.

После завершения экспозиции проявите рентгеновскую пленку в стандартном проявителе и фиксаже. Сигнал гибридизации будет выглядеть в виде черных областей на пленке, возникших в результате экспонирования зерен серебра в эмульсии, что позволит определить клеточное разрешение и увидеть сигнал непосредственно на ткани. Слайды погружают в фотографическую эмульсию, после чего проводят контрастное окрашивание.

Если стекла подлежат докрашиванию кристаллическим фиолетовым, то срезы должны быть деликвидированы согласно инструкциям в письменном протоколе. На этом этапе, работая в темной комнате, налейте дистиллированную воду в пробирку. Отберите небольшое количество эмульсии NTB и разведите эмульсию дистиллированной водой в соотношении один к одному.

После расплавления эмульсии на водяной бане при 42 °C в течение 20–30 минут перенесите ее в стеклянный контейнер для окунания, помещенный на водяную баню при 42 °C на 20–30 минут. Уровень разведенной эмульсии должен быть таким, чтобы при погружении предметного стекла оно полностью покрывало все срезы. При большом количестве предметных стекол может потребоваться дополнительный объем эмульсии.

Теперь погрузите предметные стекла в разведенную эмульсию в водяной бане при температуре 42 °C, затем высушите их в закрытом светонепроницаемом контейнере в течение ночи в темной комнате или в термостате при 37 °C в течение двух-трех часов при выключенном свете. После высушивания перенесите стекла в кассету для предметных стекол. Заклейте края черной изолентой, а затем оберните алюминиевой фольгой.

Храните кассеты при температуре 4 °C от нескольких дней до нескольких недель; когда наступит время проявления, доведите предметные стекла до комнатной температуры. Затем, работая в темной комнате, извлеките штатив с предметными стеклами из кассет и проявите их в проявителе codec D 19 при температуре 16 °C в течение 3–5 минут. После этого промойте проявленные стекла под проточной водопроводной водой при комнатной температуре в течение одной минуты.

Затем дважды инкубируйте предметные стекла в фиксирующем растворе при 19 °C по шесть минут каждое; во время второй инкубации в фиксаторе можно включить комнатный свет. Теперь промойте стекла под проточной водой при комнатной температуре в течение не менее 30 минут. Затем, пока стекло еще влажное, с помощью лезвия бритвы снимите эмульсию с его обратной стороны.

В завершение проведите контрастное окрашивание 0.3% кристалвиолетом, затем, при необходимости, обезводьте и закройте стекла согласно инструкциям в письменном протоколе. Удалите остатки эмульсии с обратной стороны стекол, смочив их водой и соскоблив излишки лезвием бритвы. Промойте стекла в 80% растворе этанола и аккуратно протрите один или два раза, чтобы удалить частицы загрязнений и пыль.

Сделайте снимки при темнопольном или светлом освещении. Этапы соскабливания и очистки может потребоваться повторить два-три раза, чтобы получить качественные изображения без частиц пыли, которые легко видны в темнопольном режиме под диссекционным микроскопом. Следующие изображения представляют собой примеры авторадиографии гибридизации in situ с рентгеновских пленок.

На данном рентгеновском снимке представлен сагиттальный срез всей головы эмбриона певчей птицы цебровой амадиньи на 10-й день развития, гибридизированный с антисмысловым рибозондом к Fox P one. Черные экспонированные зерна на пленке указывают на экспрессию матричной РНК; как видно, в головном мозге матричная РНК Fox P one обогащена в мезопаллиуме, стриатуме и дорсальном таламусе. На следующем рентгеновском снимке представлен срез той же птицы цебровой амадиньи, гибридизированный с антисмысловым рибозондом к Cuper.

TF two Co. TF two обогащен в области palam alium и в более вентральных отделах таламуса. Следующие изображения представляют собой примеры авторадиографии гибридизации in situ с предметных стекол с эмульсионным слоем. На данном изображении, полученном в темном поле под диссекционным микроскопом, показан сагиттальный срез всей головы зебровой амадины на шестой день после вылупления, который был гибридизирован с антисмысловым RIBA-зондом к Fox P one.

Белые проявленные зерна серебра в эмульсии над тканью указывают на экспрессию матричной РНК. Красный цвет соответствует окрашиванию крезиловым фиолетовым. Масштабный отрезок соответствует 1 mm.

На данном изображении представлен срез того же экземпляра певчей птицы (зебровой амадиньи), гибридизированный с антисмысловым рибозондом к coop TF two. Следующие изображения сравнивают антисмысловое и смысловое мечение, демонстрируя различные паттерны, выявленные с помощью авторадиографии на рентгеновских пленках срезов головного мозга зебровой амадиньи на 12-й день эмбрионального развития. Пунктирная линия обозначает контур всего мозга, а буква C отмечает мозжечок.

Видно, что антисмысловая цепь PAC six экспрессируется в головном мозге, особенно в вентрикулярной зоне. На соседнем срезе, гибридизированном со смысловой цепью pack six, фоновая экспрессия в голове эмбриона отсутствует, однако наблюдается отчетливая экспрессия в пигментном слое сетчатки, аналогично антисмысловой цепи. На следующих изображениях в C представлены два сигнала экспрессии генов и предметные стекла с эмульсией, полученные из мозга зебровой амадиньи на поздних стадиях эмбрионального развития, при освещении в светлом и темном полях.

На этом изображении в светлом поле показана экспрессия D one B на 10-й эмбриональный день. При нормальной экспозиции эмульсии метка, которая выглядит черной, едва заметна при данном увеличении. На этом снимке представлен тот же срез и увеличение, что и на предыдущем изображении, но в режиме темного поля, где метки в стриатуме и таламусе отображаются белым цветом.

На этом изображении в светлом поле показана экспрессия slit3 на 12-й эмбриональный день. После избыточной экспозиции эмульсии черная метка становится отчетливо видна. SC обозначает положение спинного мозга, а CB — положение мозжечка.

Ростральный конец ориентирован влево. На представленном здесь изображении показан тот же срез при том же увеличении, но в режиме темнопольного обзора, где метки в спинном мозге отображаются белым цветом и соответствуют изображению в светлом поле. На следующих изображениях показано разрешение серебряных зерен на клеточном уровне.

Здесь показано мечение мРНК Fox P1 в переднем мозге зебровой амадиньи; серебряные зерна видны в виде черных точек над клетками, окрашенными кристаллическим фиолетовым. На данном изображении видна высокая экспрессия в отдельных клетках мезопаллиума взрослой зебровой амадиньи. На данном изображении видна низкая экспрессия в отдельных клетках прилегающего паллиума того же среза.

Экспрессия мРНК Hi Fox. P one messenger в клетках наблюдается в мезоаллиуме эмбриона на 12-й день развития.

Эмбриональные клетки, представленные здесь, меньше и расположены плотнее по сравнению со взрослыми клетками на двух предыдущих изображениях. Наконец, на данном снимке видна низкая экспрессия в клетках прилежащего алиума того же среза. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, например иммунохимический анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, в частности, в каком типе клеток экспрессируется целевой ген.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить гибридизацию in situ. Не забывайте, что работа с радиоактивными реагентами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, включая использование средств индивидуальной защиты.