Профилирование тиоловых Редокс Протеом Использование изотопной масс-спектрометрии тегов

Общая цель данного эксперимента — наблюдение за воздействием Pseudomonas sire PV tomato на окислительно-восстановительно регулируемые белки в растениях томата. Сначала инокулируют растения томата Pseudomonas sire PV PV tomato для индукции инфекции патогеном и белкового ответа. Затем проводят окрашивание DIAM benzine для наблюдения за изменениями активных форм кислорода.

Затем проведите TMT-маркировку цистеинов для исследования окислительно-восстановительно регулируемых цистеинов в белках. Полученные результаты позволяют измерить различия между обработанными и контрольными образцами. Здравствуйте, я Чэнь из департамента биологии и центра протеомики Университета Флориды.

Преимущество нашего метода мечения CTMT перед существующими методами, такими как изотопное покрытие плавников (isotope coated fin tag), также известное как ASCA, заключается в возможности мультиплексирования при широкомасштабном анализе редокс-чувствительных белков. Хотя данная демонстрация позволит получить представление о редокс-регулируемых белках томата в ответ на инфекцию патогеном, эксперимент может быть применен к другим системам, таким как joof, мыши cu, другие растения, а также для контроля условий стресса. Впервые идея этого метода возникла у нас после того, как мы заметили значительные различия в экспериментах ICAD из-за доступности всего двух меток.

Демонстрация данного метода в формате VIR имеет критическое значение, так как этапы маркировки и обогащения трудно освоить. Необходимо свести к минимуму экспериментальные различия между маркированными образцами и сократить объем удаляемых участков для обеспечения эффективной маркировки. Приступим к работе. Для получения инокулята вырастите два пересаженных проростка томата примерно одного размера в горшках диаметром четыре дюйма.

Газон Pseudomonas syringae на чашке с KBM. Соскребите бактерии в 20 миллилитров воды и приготовьте бактериальный инокулят с концентрацией около 10⁶ колониеобразующих единиц на миллилитр. Погрузите четырехнедельные растения в раствор бактериального инокулянта в одном литре инокуляционного буфера на 30 секунд.

Затем немедленно накройте прозрачными пластиковыми пакетами. По истечении предпочтительного времени инокуляции соберите полностью развернутый лист, поместите его эпидермальной стороной вверх в раствор DAB для окрашивания с концентрацией 1 mg/mL и подвергните вакуумной инфильтрации в течение 15 минут. Затем инкубируйте листья в темноте при комнатной температуре в течение ночи.

Теперь прокипятите окрашенные листья в 95% ethanol в течение 10 минут и храните их в 75% ethanol. С помощью ступки разотрите собранные листья в жидком азоте до состояния мелкого порошка. Затем проведите экстракцию фенолом, как описано в сопроводительном тексте.

Затем осадите белки, экстрагированные фенолом, пятью объемами холодного 0,1 молярного раствора ацетата аммония в 100% метаноле. Соберите белки путем центрифугирования и промойте осадок. После этого ресуспендируйте образцы в 1,5 мл холодного 70% этанола и перенесите в микроцентрифужную пробирку объемом два мл.

После центрифугирования удалите супернатант этанола и короткое время высушите осадок в вакуум-концентраторе. Растворите образцы в денатурирующем буфере для экстракции белков; после центрифугирования для получения осадка соберите супернатант и измерьте концентрацию белка в соответствии с руководством производителя. Для каждой из шести масс-меток возьмите 100 µg образца белка в равном объеме свежеприготовленного 200 mM иодацетамидного алкилирующего буфера для блокирования свободных тиольных групп; инкубируйте при 37 °C в течение одного часа. Затем для осаждения белков добавьте 1 mL холодного 80% ацетона и выдержите при −20 °C в течение ночи.

Осадите белок путем центрифугирования и проведите три промывки 80% acetone. После высушивания образцов на воздухе на льду повторно суспендируйте осадок в 50 µL лизирующего буфера. Затем для восстановления дисульфидных связей добавьте 0.5 µL 100 mM TCEP и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.

Растворите метки, добавив 20 µL ацетонитрила в пробирки с реагентами. Перемешайте на вортексе и центрифугируйте. Далее, чтобы удалить избыток TCEP, нанесите 50 µL образца на колонку MicroCon 3 KD. Добавьте 50 µL лизирующего буфера и центрифугируйте в течение 15 минут при 10,000 ×g и 4 °C.

Для сбора образца извлеките колонку, переверните её в чистую пробирку и центрифугируйте. При необходимости проверьте pH образца. Доведите значение pH до диапазона от семи до восьми с помощью одного молярной соляной кислоты.

Добавьте 5 µL реагента TMT для цист и инкубируйте реакционную смесь в течение двух часов при комнатной температуре, объедините образцы, добавьте равный объем буфера для образцов Laemmli, прокипятите в течение пяти минут и проведите разделение на готовом 12%-ном полиакриламидном геле; после трехкратного промыва не геля фильтрованной водой окрасьте его кумасси синим в течение одного часа и оставьте на ночь в воде, исходя из концентрации белковых полос. Разделите каждую дорожку геля на 12 фракций. Нарежьте каждую фракцию кусочками по 1 мм и поместите в пробирку объемом 1,5 мл.

Полностью погрузите фрагменты геля в 0,1 молярный раствор бикарбоната аммония в 50% ацетонитриле. Затем залейте фрагменты 100% ацетонитрилом на 15 минут. Удалите жидкость и высушите фрагменты с помощью вакуум-концентратора (speed vac).

Затем добавьте равный объем раствора трипсина и поместите на лед для регидратации. После этого инкубируйте при 37 °C в течение 12–16 часов для трипсинолиза. Затем отберите жидкий белковый экстракт из инкубированных образцов.

Остановите реакцию и удалите остатки протеинового дигеста, залив фрагменты геля 5% formic acid в 50% acetonitrile. Затем встряхивайте фрагменты геля в течение 20 минут при комнатной температуре. Перенесите супернатант в пробирки с экстрагированным белком; повторите экстракцию еще дважды.

Высушите образцы в вакуум-концентраторе (speed vac) в пробирках объемом 0,5 мл. Приготовьте 50% суспензию смолы anti TMT в TBS в концентрации, пропорциональной интенсивности соответствующей полосы белка. Промойте смолу трижды одним объемом колонки 1× TBS, затем добавьте по 200 мкл TBS в каждый образец.

Затем перенесите смесь на смолу с антителами к TMT и перемешивайте при комнатной температуре в течение двух часов, после чего оставьте на качалке на ночь при температуре четырех градусов Цельсия. Нанесите каждый образец на колонку. Выполните промывку колонки порциями по 200 µL каждая.

Затем промойте каждый образец трижды 200 µL 50% буфера для элюции и высушите под вакуумом. Перевзвесьте образцы в 12 µL 3% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислотой и введите 5 µL непосредственно в колонку ВЭЖХ. Элюируйте пептиды, используя градиент с увеличением концентрации ацетонитрила, как подробно описано в сопроводительном тексте.

Используйте масс-спектрометрию для обнаружения пептидов по схеме «top two by three». Начните с одностадийного масс-спектра (ms). Затем снимите три Ms.Ms спектра с использованием фрагментации путем диссоциации в ловушке с повышенной энергией (HCD), за которой следуют три последующих спектра.

МС/МС с диссоциацией, индуцированной столкновением, для идентификации белков. Анализ масс-спектрометрических данных с использованием разветвленного рабочего процесса. Применение квантификатора репортерных ионов для определения соотношения.

Также обработайте масс-спектр MSM с помощью узлов селектора спектров, нормализатора спектров и группировщика спектров, выполнив запрос данных в поисковом движке Sequest. На этом изображении представлены примеры листа контрольного растения томата слева и листа, инокулированного Pseudomonas, справа после окрашивания листьев с помощью DAB. Процесс окрашивания DES позволяет гистохимическому красителю выявить признаки активных форм кислорода в тканях листа.

Как и ожидалось, в контроле значимого окрашивания не наблюдается, в то время как листья, обработанные Pseudomonas, окрашиваются положительно на продукцию перекиси водорода. Данный пример демонстрирует результат анализа протеома: площадь пика белка с дифференциальной редокс-регуляцией для каждого образца позволяет провести абсолютный количественный анализ. Различие в площади пиков между контрольными и инокулированными образцами указывает на относительное количество.

В данном случае окислительно-восстановительная регуляция белка в контрольном и инокулированном образцах схожа. Пики аналогичной интенсивности указывают на наличие дисульфидных связей, которые не регулируются изменением условий обработки. После освоения данный метод можно будет выполнять надлежащим образом в течение одной недели.

Помните о необходимости поддерживать низкую температуру образцов и следить за порядком маркировки. Также соблюдайте меры предосторожности при работе с фенолом, такие как использование перчаток и выполнение данной процедуры в вытяжном шкафу. Для определения других модификаций системы, например, олеиновой кислоты и глутатионилирования, могут быть проведены дополнительные исследования, такие как специфический масс-спектрометрический анализ посттрансляционных модификаций.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как выполнять активацию DIB standing CTMD и квалификацию redox 16.