Пространственно-временные манипуляции малых активность ГТФ на субклеточном уровне, и на шкале времени секунды в живых клетках

В этом видео демонстрируется метод, при котором ультрафиолетовое излучение используется для манипулирования активностью белка на плазматической мембране. Для этого клетки подвергаются трансфицированию мембранного белка FRB и представляющего интерес слитого белка FK BP. К носителю добавляется производное рапамицина в клетке.

Затем во время визуализации живых клеток ультрафиолетовый свет подается на определенную область клетки. Линкером между рапамицином и биотином является расщепленный высвобождающий химический димеризатор и его побочный продукт, высвобожденный димеризатор, диффундирует в клетки и индуцирует димеризацию между интересующим белком, меченным FKBP, и плазматической мембраной, закрепленной FRB в облученной области. Без ультрафиолетового излучения FKBP и FRB не связываются, следовательно, не производят никакого эффекта.

Анализ данных выявляет высоколокализованное рекрутирование представляющего интерес слитого белка FKBP на основе его физиологического эффекта. Преимущество этой методики перед существующими методами, такими как фармакологический и генетический подходы, заключается в сочетании скорости действия, специфичности мишени и пространственного разрешения. Последствия этого метода распространяются и на терапию метастатического рака как следствие миграции раковых клеток.

Таким образом, манипулирование активностью ключевых миграционных факторов может выявить его точный молекулярный механизм, что является предпосылкой для его лечения и излечения. Демонстрировать процедуру будут Крис Пол Мейер, аспирант, и Боб де Роуз, техник из моей лаборатории. Начните этот протокол с объединения следующих в стерильную микроцентрифужную пробирку: плазмиду, ДНК, мембрану, привязанную FRB, флуоресцентно меченную FKBP, ТИА одну и деионизированную воду, добавьте один микролитр нескольких генов HD в смесь и вихрь.

Инкубируйте трубку при комнатной температуре в течение 20 минут. Во время инкубации добавьте по 50 микролитров поли-делицина в каждую лунку со стороны стеклянной камеры с восемью лунками и инкубируйте в течение одной минуты, чтобы покрыть поверхность, затем отсасывайте раствор и промойте центр каждой лунки 50 г деионизированной водой. Далее трипсин на 80-85% состоит из трех Т-трех клеток NIH.

После того, как клетки отделятся, добавьте 10 миллилитров DMEM, содержащего 10% FBS, перенесите 375 микролитров суспензии в стерильную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 1500 G в течение трех минут. Следуя за вращением, осторожно отсасывайте среду. Добавьте 750 микролитров DMEM с 10% FVS и Resus.

Подвесьте гранулу, осторожно пипетируя вверх и вниз несколько раз. Наконец, добавьте клеточную суспензию в раствор для трансфекции и, осторожно перемешав наконечник пипетки, добавьте 250 микролитров суспензии для трансфекции клеток в каждую лунку камеры. Сдвиньте и инкубируйте его.

37 градусов Цельсия от 15 до 18 часов. Для синтеза кейджа рапамицина, аддукта биотина. Начните с приготовления одномиллимолярного стокового раствора CRB в ДМСО в стерильной фуге-пробирке в отдельной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, растворите один миллиграмм авадона в 250 микролитрах PBS.

Далее сопрягают клетку с рапамицином. Добавьте 0,5 мкл стокового раствора CRB к растворенному AVID в перемешанном путем инвертирования несколько раз и затем выдерживайте комнатную температуру в течение 15 минут. Для получения CRB AVID в сопряженном растворе для исключения несвязанных малых молекул и очистки CRBA уравновесьте колонку исключения размера G 25 с 300 микролитрами PBS.

Повторите пять раз после того, как столбец уравновесится. Загрузите 125 микролитров раствора CRBA на центральную подушку колонны. Затем убавьте раствор в течение двух минут при 800 G При комнатной температуре соберите поток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра после трансфекции клеток.

Замените среду на DMEM без FBS, чтобы сыворотка голодала, клетки инкубировались в течение 12 часов. После инкубации аккуратно отсасывайте среду и добавьте 250 микролитров приготовленного одного микромолярного раствора CRBA. Далее, чтобы визуализировать динамику белков в живых клетках, используйте конфокальный микроскоп с вращающимся диском и ультрафиолетовым освещением, чтобы соединить оптику для ультрафиолетового светодиодного света с яркостью 365 нанометров.

С эпифлуоресцентным светом. Определите координаты и размер светового пятна с помощью стеклянной пластины, покрытой флуоресцентными красителями, возбуждаемыми ультрафиолетовым светом. Это позволяет точно настроить облучаемую область.

Поместите предметное стекло с ячейками на сцену с помощью 100-кратного объектива и эпифлуоресценции. Сосредоточьтесь на клетках и найдите ячейку. Для визуализации начинайте визуализацию клеток после определения фоновых уровней физиологического эффекта.

Здесь измеряется облучение ультрафиолетовым светом в одном выбранном квадранте клетки, растворение без оболочки, таким образом, исходный рапамицин в ДМСО, а затем в PBS до конечной концентрации 400 наномоляров. Добавьте 100 микролитров раствора в камеру визуализации, чтобы вызвать глобальные эффекты. Делайте флуоресцентные изображения каждые 15 секунд в течение 20 минут, чтобы определить, может ли локализованная активация RAC вызвать локальное образование оборки.

Три Т-три клетки NIH трансфицировали меченным YFP активатором RAC FK BP, TIA 1 и LDR, который представляет собой мембрану, закрепленную в ней. Локализованное излучение FRB на краю ячейки, обозначенном желтым кругом, сопровождалось глобальным освещением ртутной лампой в течение одной секунды, начиная с 1063 секунды. Как видно на рисунке, в начале мембранного взъерошивания практически не было.

Однако после локализованного освещения наблюдалось пространственно ограниченное возбуждение после глобального освещения и добавления рапамицина, что вызывает транслокацию FK bp TIA one к плазматической мембране. В клетке наблюдалось глобальное образование рюшей, что указывает на то, что ранее наблюдавшееся локальное образование рюши было вызвано пространственно ограниченной активацией стойки. Для количественного анализа клетки-мишени были разделены на четыре квадранта и определена частота образования рюшек в каждом квадранте при локальной и последующей глобальной стимуляции, как показано на этом графике.

Ни в одной из наблюдаемых клеток не было обнаружено образования оборок при CRBA без уве-излучения или локального уве, облучении с Аденом или без него в объемной среде. Однако, когда был добавлен CRBA и было проведено ультрафиолетовое облучение, образование рюши наблюдалось примерно на том же уровне, примерно в 90% во всех квадрантах с глобальным излучением, когда облучался только первый квадрант, частота образования рюшей составляла 100% по сравнению с 30%25% и 30% в квадрантах со второго по четвертый. Эти результаты указывают на то, что локализованное освобождение рапамицина может быть использовано для индуцирования высоколокализованных физиологических эффектов в одной клетке.

В этом случае взъерошивание мембраны вызвано активацией стойки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как достичь пространственно-временного контроля активности малых g TPA с помощью света. Этот метод может быть применен к любому физиологическому процессу, который зависит от перемещения специфических белков в плазматическую мембрану.

Приступая к этой процедуре, важно помнить о свежей подготовке растворов, реагентов и клеток для каждой процедуры. Не забывайте, что работа с ультрафиолетовым излучением может быть чрезвычайно опасной, и всегда следует носить такие меры предосторожности, как УФ-очки.