Инженерные и эволюции Синтетическая адено-связанный вирус (AAV) генной терапии векторы с помощью ДНК семьи Перетасовка

Общая цель следующего эксперимента заключается в создании высокодиверсифицированной библиотеки синтетических капсидов аденоассоциированного вируса (AAV), из которой можно отобрать частицы с заданными свойствами. Это достигается путем первоначальной фрагментации, клонирования и селекции генов капсида AAV с помощью контролируемого переваривания ДНАЗ I для их последующей сборки в химерные последовательности посредством двух реакций ПЦР. На втором этапе полученный продукт ПЦР клонируется обратно в репликативно-компетентную конструкцию AAV для создания плазмидной библиотеки, содержащей не менее 1 миллиона различных генов капсида AAV.

Затем эта библиотека плазмид трансфицируется в клетки 2 9 3 T вместе с аденовирусной вспомогательной плазмидой для создания библиотеки химерных вирусов, которая в дальнейшем может быть отобрана на клетках-мишенях или на животных. Результаты демонстрируют успешную молекулярную инженерию и эволюцию новых синтетических векторов A A V на основе усиленной или более специфичной экспрессии репортерного гена в культивируемых клетках или у взрослых мышей. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как пептидный дисплей, является то, что перетасовка семейств ДНК позволяет одновременно изменять и улучшать несколько характеристик капсида AV: от связывания с клеткой и внутриклеточного транспорта до раздевания и экспрессии гена в ядре.

Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области генной терапии и вирусологии, например, как получить идеальный вектор для конкретного терапевтического применения или как проанализировать домены вирусного капсида, ответственные за определенное свойство. Значимость данной методики распространяется на терапию множества заболеваний человека, включая инфекции, вызванные вирусными патогенами, поскольку наш метод позволяет осуществлять молекулярную эволюцию AAV-векторов, которые специфично и эффективно инфицируют вирусные клетки-мишени, такие как T-клетки при ВИЧ или гепатоциты при гепатитных вирусах. Кроме того, этот метод позволяет глубже понять биологию AAV и может быть использован для совершенствования AAV-векторов для генной терапии.

Данный метод также может быть легко применен к другим семействам генов, имеющим фундаментальное или прикладное значение, таким как гены, кодирующие флуоресценцию, три репортера, клеточные ферменты или белки, участвующие в РНК-интерференции. Идея этого метода возникла у нас, когда мы пытались подобрать подходящий вектор для трансдукции тканей взрослых мышей терапевтическими генами и поняли, что все природные серотипы AV имеют такие недостатки, как высокая распространенность в человеческой популяции и, соответственно, высокая частота возникновения иммунного ответа или низкая эффективность in vivo, несмотря на эффективную трансдукцию гепатоцитов in vitro. Визуальная демонстрация этого метода имеет критическое значение, поскольку фрагментация гена капсида AV на основе ДНК и некоторые этапы производства вирусной библиотеки трудноосваиваемы, так как требуют опыта и понимания критических стадий, что позволит облегчить рутинную подготовку достаточного количества различных генов капсида аденоассоциированного вируса.

Для перетасовки ДНК эти гены сначала субклонируют в общую плазмидную основу. Для этого искомые гены cap сначала амплифицируют с помощью ПЦР из общедоступных плазмид AAV, используя праймеры cap F и cap R. Затем гены cap клонируют в плазмиду, сконструированную таким образом, чтобы она содержала специфические сайты связывания праймеров, а также сайты рестрикции. В данном примере ген cap клонируют в сайты PAC one и SC one, которые присутствуют в праймерах, используемых для амплификации cap, и в реципиентной плазмиде, но отсутствуют в большинстве AAV. После создания наборов плазмид, кодирующих гены капсида AAV, начинают процедуру перетасовки cap с помощью ПЦР, амплифицируя выбранные гены cap с использованием праймеров T three и T seven.

Подготовьте ПЦР-реакционную смесь объемом 50 µL, содержащую 200 ng плазмиды cap, каждый праймер в конечной концентрации 2 µM, 10 µL 5x буфера High Five и 1 µL полимеразы High Five. В результате данной реакции получится около 3 µg ПЦР-продукта, чего достаточно для проведения до шести реакций перетасовки (shuffling), в зависимости от количества генов cap, которые будут включены в библиотеку. Программу амплификации установите следующим образом: начальный heating в течение 5 минут при 95 °C, затем 40 циклов, состоящих из 15 секунд при 94 °C, 30 секунд при 57 °C и 3 минут при 68 °C, и финальный этап в течение 10 минут при 72 °C.

После очистки продуктов ПЦР для создания фрагментов гена cap, необходимых для последующей сборки в Kyra, проводят контролируемый гидролиз ДНК. Одним из наиболее сложных аспектов данной процедуры является получение определенного диапазона длин переваренных фрагментов ДНК гена cap для сборки в kyras; с этой целью изначально подготавливают избыточное количество очищенных генов cap, после чего ставят несколько параллельных реакций с различными условиями. Чтобы обеспечить равномерность гидролиза, смешайте различные продукты ПЦР гена cap до достижения общего количества 4 µg в 54 µL воды, затем осторожно добавьте в реакционную смесь 6 µL буфера для реакции DS и 0.5 µL DNAs one. Тщательно перемешайте содержимое пробирки тремя переворотами, кратковременно центрифугируйте и немедленно поместите на нагревательный блок с температурой 25 °C.

Инкубируйте первую реакцию в течение одной минуты. Затем подготовьте вторую реакцию расщепления, но инкубируйте её при 25 °C в течение одной минуты и 15 секунд. Таким образом, установите несколько параллельных реакций с временем инкубации от одной до двух минут, изменяя время инкубации с шагом в 15 секунд.

Остановите каждую реакцию, добавив 6 µL 25 мМ EDTA. Кратковременно перемешайте содержимое пробирки на вортексе и инкубируйте в течение 10 минут при 75 °C. В результате нескольких параллельных реакций будут получены пять образцов белков капсида, переваренных с ДНК, по одному для каждого варианта времени инкубации; очистите фрагменты капсида на стандартном 1% agarose геле.

В идеале должен быть виден шлейф в диапазоне от 100 до 500 пар оснований, как показано на этом примере с начальным временем инкубации одну минуту, 45 секунд или две минуты. При перемешивании семейств ДНК фрагменты кэпа сначала собираются в полноразмерные последовательности с помощью ПЦР, в которой они самопраймируются за счет частичных гомологий. Подготовьте реакционную смесь объемом 50 µL, содержащую 500 ng очищенных фрагментов, 10 µL 10-кратного буфера для слияния, 1 µL 10 mM dNTPs, 1,5 µL DMSO и 0,5 µL полимеразы для слияния.

Две полимеразы инкубируют в течение 30 секунд при 98 °C, затем проводят 40 циклов: 10 секунд при 98 °C, 30 секунд при 42 °C и 45 секунд при 72 °C, с последующим финальным этапом в течение 10 минут при 72 °C. Затем проводят амплификацию реассемблированных генов кэпа для последующего клонирования с помощью второй ПЦР, используя праймеры, которые связываются с консервативными фланкирующими последовательностями. Например, для наборов SAF и SAR или CUF и CUR готовят реакционную смесь объемом 50 µL, содержащую по 2 µL продукта первой ПЦР, каждый праймер в конечной концентрации 2 µM, 0,5 µL хлорида магния, 10 µL 5x буфера high-FI и 1 µL полимеразы high-FI.

Для обеспечения достаточно высокого выхода продукта для последующего клонирования рекомендуется провести от 16 до 24 ПЦР. После объединения продуктов ПЦР и очистки полноразмерной полосы капсида следующим этапом является расщепление очищенного пула генов капсида с помощью PAC one и ASC one для клонирования в репликативно-компетентную плазмиду aav. Реципиентная плазмида содержит инвертированные концевые повторы aav, фланкирующие ген rep AAV two под контролем промотора AAV P five, а также PAC one и ASC one.

Сайты рестрикции, расположенные ниже rep, позволяют осуществлять клонирование пула перемешанных cap с сохранением рамки считывания. Сайты связывания праймера LSE, отмеченные стрелками, полезны для секвенирования гена cap; смешайте фрагменты cap и соответствующим образом разрезанный остов реципиентной плазмиды в молярном соотношении три к одному. Приготовьте мастер-микс общим объемом 40 µL, достаточный для 20 трансформаций, с конечной концентрацией ДНК 15 ng/µL.

Инкубируйте в течение ночи при 16 °C; на следующий день проведите трансформацию продуктов реакции лигирования в клетки e coli. Смешайте 2 µL реакции лигирования с 30 µL электрокомпетентных клеток e coli и перенесите смесь в предварительно охлажденные кюветы для электропорации на льду; проведите электропорацию при 1,8 kV, 200 ohms и 25 µF. Постоянная времени должна быть близка к 5 ms. Сразу после этого добавьте 1 mL предварительно подогретой среды SOC и перенесите культуру в колбу объемом 250 mL.

20 таких процедур электропорации позволят получить библиотеку с разнообразием примерно 1 × 10⁶ различных клонов. Добавьте один объем предварительно нагретой среды SOC к объединенным трансформированным клеткам и инкубируйте при 37 °C и 180 RPM в течение одного часа. Затем добавьте 40 мл объединенных трансформированных клеток к 800 мл среды LB с ампициллином и инкубируйте еще 16 часов при тех же условиях; после этого плазмидная ДНК библиотеки очищается с помощью имеющегося в продаже коммерческого набора.

Создание вирусной библиотеки начинается с трансфекции клеток HEC 2 9 3 T библиотекой a a v. Для этого посейте клетки HEC 2 9 3 T в 10 чашек размером 15 см² и культивируйте их в течение 48 часов при 37 °C. Для каждой трансфекции приготовьте две следующие смеси реагентов в двух отдельных пробирках. В первой пробирке указаны следующие количества на 10 чашек.

Смешайте 7.9 milliliters хлорида натрия и ДНК, затем добавьте воду до общего объема 15.8 milliliters. Во вторую пробирку добавьте 3.52 milliliters полиэтилениммина, 7.9 milliliters хлорида натрия и 4.38 milliliters воды. Объедините смеси, перемешайте на вортексе и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре, затем равномерно распределите раствор по каждой чашке с клетками 2 9 3 T. Инкубируйте при 37 degrees Celsius.

Через 48 часов можно собрать вирусную библиотеку. Соскребите клетки в среду, объедините клетки из всех чашек в одной пробирке и центрифугируйте при 1200 RPM в течение 15 минут. Ресуспендируйте клеточный осадок в шести миллилитрах лизирующего буфера, а затем подвергните пяти циклам замораживания-оттаивания; после пяти циклов замораживания-оттаивания инкубируйте с Ben Nase в течение одного часа при 37 °C.

Затем осадите клеточный дебрис центрифугированием при 3 750 RPM в течение 20 минут. Подготовьте градиент для очистки вируса, используя пастельную пипетку для внесения 5 мл вирусной суспензии в центрифужную пробирку Beckman Quicks seal, затем добавьте по 1,5 мл 15%, 25% и 40% растворов йодикса. Долейте градиент до верха лизирующим буфером и центрифугируйте в ультрацентрифуге при 50 000 K в течение двух часов при температуре 4 °C.

По завершении ультрацентрифугирования извлеките пробирку из ротора и протрите ее внешнюю поверхность 70% ethanol. Вставьте иглу в верхнюю часть пробирки для вентиляции, а с помощью другой иглы отберите 1.2 milliliters фракции 40% IOL. Будьте осторожны, чтобы не забрать жидкость из фракции 25%, так как она содержит пустые везикулы.

Капсиды AAV. Отдельные клоны из исходной библиотеки плазмид анализируют на функциональность и разнообразие путем создания с их помощью рекомбинантных векторов AAV, экспрессирующих репортерный ген. Затем культивируемые клетки или животные заражают различными количествами очищенного вируса и определяют эффективность трансдукции.

Здесь представлены результаты флуоресцентной микроскопии трех линий клеток человека, инфицированных пятью различными рекомбинантными AAV-векторами, экспрессирующими YFP и содержащими перетасованные гены капсида. Альтернативным методом анализа эффективности трансдукции является измерение экспрессии флуоресцентного репортерного гена с помощью проточной цитометрии. На данном рисунке показан типичный результат для четырех типов клеток: почек человека, шейки матки человека, фибробластов мыши и Т-клеток человека, инфицированных 18 различными рекомбинантными AAV-векторами, экспрессирующими YFP и содержащими перетасованные гены капсида, которые были случайным образом отобраны из исходной библиотеки.

Экспрессия YFP была обозначена цветовым кодом для более удобной визуализации. Представленные данные отображают процент трансдуцированных клеток, где черный цвет соответствует 0%, а белый — максимальному значению, измеренному для каждого клона клеточного типа. Клон B2 (красный) служит примером клона с низкой общей эффективностью, что ожидаемо для неселектированных капсидов. Затем вирусная библиотека может быть проскринирована на наличие отдельных частиц, проявляющих большинство или все желаемые свойства в данной клеточной линии или на животных для проведения селекции.

В культурах клеток сначала проводят коинфицирование клеток различными аликвотами библиотеки и вируса ENO five для поддержки роста a a v, затем клетки собирают, а амплифицированный a a v экстрагируют и используют для повторного заражения новых клеток. Определение оптимального соотношения a a v и аденовируса для коинфицирования клеток имеет важное значение, и хорошим показателем эффективной инфекции arius является появление цитопатических эффектов через три дня после инокуляции вируса, что проявляется округлением и отслаиванием клеток; на данном рисунке в верхней левой панели показаны незараженные клетки, в то время как на остальных панелях представлены клетки, зараженные указанным количеством частиц аденовируса на клетку. Другим полезным методом контроля инфекции и амплификации a a v является определение белков капсида с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела B one, которое распознает высококонсервативный эпитоп капсида a a v.

На левом блоте показаны клетки, коинфицированные различными объемами в микролитрах библиотеки a a V и хелперным вирусом ENO. Первые две дорожки являются хорошими примерами условий, при которых экспрессия белка a a v едва обнаруживается, что указывает на достаточное, но не избыточное инфицирование и амплификацию a a v и, следовательно, на желаемую тесную связь между генотипом и фенотипом. Таким образом, для реинфицирования свежих клеток использовали 0,11 или 10 микролитров этих супернатантов.

Результаты вестерн-блоттинга представлены в правых ячейках. В LA c была проведена инфекция только с v в качестве отрицательного контроля. Также крайне важно контролировать разнообразие библиотеки в ходе повторных раундов инфекции с помощью секвенирования ДНК.

На данной схеме представлено сравнение белковых последовательностей клонов AAV из библиотеки на основе AAV2, AAV8 и AAV9 до и после селекции; последовательности выше красной линии соответствуют родительским AAV. Фиолетовые стрелки указывают на события гомологичной рекомбинации. Красная стрелка отмечает кроссинговер между AAV2 и AAV9, отмеченный во всех селектированных клонах. Для селекции на животных библиотека AAV вводится в организм животных, после чего последовательности извлекаются из целевых клеток или тканей с помощью ПЦР, затем заново клонируются и упаковываются для нового раунда инфицирования.

Здесь представлен пример восстановления успешно инфицированных клонов aav из печени мыши через одну неделю после периферического введения библиотеки. В первой дорожке видна ожидаемая полоса размером 2,2 килобазы, а вторая дорожка представляет собой контрольный образец без матрицы; размеры полос маркера ДНК в дорожке M указаны в килобазах. Независимо от процедуры отбора, обогащенные варианты капсида должны быть в конечном итоге валидированы в соответствующих системах.

Здесь представлен пример превосходных характеристик обогащенной химеры AAV в культурах клеток. Более темные цвета указывают на более высокую инфекционность на количество частиц, следовательно, на клон. AAV-DJ превосходит совокупность восьми природных диких типов AAV в широком спектре клеточных линий.

Наконец, представлен анализ выбранного клона AAV KYMERA в печени мыши. AAV DN был отобран на клетках гепатомы и затем использован для создания рекомбинантных векторов, экспрессирующих люциферазу; результаты показаны для репрезентативных мышей (по три в группе) через одну неделю после периферического введения равных доз данного вектора или контрольного вектора на основе дикого типа AAV8, одного из самых мощных известных природных изолятов для печени мыши. Обратите внимание, что хотя клон AAV DN обеспечивает несколько более низкий общий уровень экспрессии в печени, он обладает более высокой специфичностью к этому органу, так как демонстрирует существенно меньшее внецелевое воздействие в непеченочных тканях после корректировки уровней экспрессии в печени с помощью программного обеспечения для визуализации.

Данная методика может быть выполнена за одну неделю, начиная с амплификации генов капсида AV и заканчивая созданием вирусной библиотеки, при условии правильного соблюдения всех этапов. При выполнении данной процедуры важно помнить, что представленный здесь протокол основан на нашем опыте селекции природных серотипов AV, и вполне возможно, что некоторые условия потребуют адаптации и точной настройки при создании собственных специализированных библиотек другими пользователями. Помимо данной процедуры, для создания высокодиверсифицированных библиотек или попытки дальнейшего улучшения свойств капсидов, созданных и обогащенных с помощью перетасовки ДНК семейств (DNA family shuffling) после их разработки, могут быть использованы другие методы, такие как сайт-направленный пептидный дисплей с помощью AGENESIS или рандомизация на основе ПЦР.

Данный метод открыл перед исследователями в области вирусной доставки генов возможности для изучения терапевтических стратегий лечения заболеваний и соответствующих целевых клеток, для которых традиционные типы AAV давали неудовлетворительные результаты (например, при ВИЧ-инфекции и для T-клеток), а также для изучения векторного переноса генов в стволовые клетки человека и другие трудноинфицируемые клетки в культуре. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как конструировать и эволюционировать высокодиверсифицированные библиотеки синтетических аденоассоциированных вирусных векторов, используя комбинацию фрагментации и реассемблирования генов, а также о том, как проводить принципиальный отбор этих библиотек в культивируемых клетках или на животных для обогащения отдельных капсидов специфическими свойствами, необходимыми для использования в качестве векторов переноса генов. Не забывайте, что работа с аденовирусами может быть опасной, и при выполнении данной процедуры необходимо соблюдать множество мер предосторожности.