Первичная система культуры нейронов по изучению простого герпеса латентности вирусов и реактивации

Целью данного эксперимента является демонстрация того, как систему первичной культуры нейронов можно использовать для изучения латентности и реактивации вируса простого герпеса. Это достигается путем первоначального выделения нейронов верхних шейных ганглиев из эмбрионов крыс линии RA и культивирования нейронов, выделенных из диссоциированных ганглиев после удаления ненейрональных клеток. Латентная инфекция HSV создается с помощью вируса EGFP для инфицирования нейронов в присутствии ингибитора литической репликации.

Следующим шагом является индуцирование реактивации латентно инфицированных культур. Наконец, эффективность реактивации оценивают путем мониторинга экспрессии EGFP с течением времени. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие, как различные пути нейрональной сигнализации регулируют латентность и реактивацию вируса простого герпеса при использовании химических ингибиторов, РНК-интерференции и доставки генов.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами является то, что она позволяет детально изучать на молекулярном уровне взаимодействия, регулирующие латентность вируса простого герпеса в нейроне хозяина. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения латентности вируса простого герпеса, такие как: какие сигналы способствуют репрессии латентного генома и каким образом на молекулярном уровне запускается реактивация? В нейронах данный метод может дать представление о латентности HSV-1.

Данный метод также может быть применен к другим нейротропным альфа-герпесвирусам. Демонстрацию процедуры проведут Мариго Кочи и Джулиан Ким, аспиранты наших лабораторий. Нейроны верхних шейных ганглиев (SCG) для данного протокола выделяют из эмбрионов крыс на 21-й день развития (E 21), извлеченных из матки беременной самки крысы. Работая под диссекционным колпаком, усыпите каждого эмбриона, совместив ножницы с основанием шеи чуть выше плеч, и отделите голову от туловища. Чтобы обнажить ганглии, зафиксируйте голову иглами 23-го калибра в трех точках, расположив голову шеей вверх.

Сначала закрепите спинной мозг булавками. Затем оттяните кожу передней поверхности через нос и зафиксируйте её булавками, а затем закрепите пищевод и трахею, отведя их от задней части шеи. Найдите верхний шейный ганглий (SCG), ориентируясь по бифуркации сонной артерии.

Сонная артерия представляет собой парную структуру. С каждой стороны шеи имеется по одной бифуркации, таким образом, у одной особи присутствует два SCG. SCG расположен непосредственно под этой ветвью.

Отделите SCG от артерий, раздвигая бифуркацию за два ее конца. SCG полупрозрачные и бесцветные по сравнению с непрозрачной желтоватой жировой тканью, окружающей бифуркацию. Поместите ганглии в 12 milliliters L 15.

Среда с добавлением глюкозы в конической пробирке объемом 15 мл на льду. После того как все SCG будут собраны из эмбрионов и осторожно извлечены, центрифугируйте ганглии в течение одной минуты при 600 об/мин, затем удалите излишки среды.

Суспендируйте ганглии в одном миллилитре среды L 15, содержащей трипсин и коллагеназу. Инкубируйте в течение 24 минут при 37 °C.

Перемешивайте каждые восемь минут. Затем добавьте 10 milliliters морской среды для инактивации трипсина и центрифугируйте в течение одной минуты. При 600 RPM удалите как можно больше среды с трипсином и коллагеназой, после чего промойте ганглии 10 milliliters среды С, центрифугируя в течение одной минуты при 600 RPM.

Повторите эту промывку один раз. Удалите промывочную среду и ресуспендируйте ганглии в одном миллилитре среды C для диссоциации, проводя тритурацию с помощью иглы 21G, прикрепленной к пятимиллилитровому шприцу, в течение максимум 15 циклов «вверх-вниз». Завершите тритурацию, используя иглу 23G, до тех пор, пока большая часть агрегатов не распадется.

Удалите оставшиеся скопления клеток, профильтруйте диссоциированные нейроны через нейлоновый фильтр с размером пор 70 micron в коническую пробирку объемом 50 milliliter. Отберите аликвоту 10 microliter профильтрованной клеточной суспензии и смешайте с трипан синим для определения количества живых клеток. Подсчитайте количество клеток, которые активно исключают краситель, используя гемоцитометр.

Затем внесите от 5 000 до 6 000 живых клеток в 100 µL среды C в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования тканей, предварительно покрытого коллагеном и ламинином; среда C должна содержать 50 ng/mL фактора роста нервов. Инкубируйте в течение ночи при 37 °C. На следующий день, в первый день культивирования in vitro или DIV 1, проверьте правильность прикрепления нейронов и наличие роста аксональных отростков.

Замените среду C в лунках на 50 µL нейробазальной среды или NBM, содержащей NGF, Acho и 5-фтор-2'-дезоксиуридин. Заменяйте среду поочередно в каждом ряду, чтобы предотвратить высыхание клеток. Инкубируйте культуры при 37 °C в течение пяти дней.

Ежедневно контролируйте состояние культуры, чтобы подтвердить гибель ненейрональных клеток и рост нейронов. Перед началом этого этапа процедуры на шестой день in vitro убедитесь, что большая часть ненейрональных вспомогательных клеток была элиминирована. Чрезвычайно важно постоянно сводить к минимуму любые ненужные физические манипуляции с нейронами.

Смену среды необходимо проводить очень осторожно и медленно, так как возникающий при этом механический стресс может повлиять на жизнеспособность нейронов. Добавьте ацикловир или контрольный вариант (CV) в существующую среду в каждой лунке до конечной концентрации 100 micromolar. Добавляйте CV медленно и аккуратно, чтобы механическое воздействие не оказало негативного влияния на клетки на следующий день.

На 7-й день in vitro (DIV 7) заразите культуры SCG рекомбинантным вирусом HSV 1, экспрессирующим репортер EGF, слитый с вирусным литическим белком US 11, с множественностью заражения от 1 до 2. Добавьте разведенный вирус непосредственно в имеющуюся среду в лунке. Включите контрольную группу с имитацией заражения (mock infection) и группу с литической инфекцией.

Положительный контроль в среде без CV. Позвольте инфекции протекать в течение двух-трех часов при 37 °C. Затем замените инфекционную среду на свежую NBM, содержащую NGF и CV. Крайне важно действовать очень осторожно при замене инфекционной среды. Наклоните планшет к себе и медленно удалите среду с дна лунки.

Затем направьте кончик пипетки к стенке лунки, а не к ее дну, и позвольте среде осторожно стечь на клетки. Заменяйте среду в одном ряду за раз, чтобы клетки не пересыхали. Верните культуры в инкубатор, перенося их максимально осторожно, чтобы не нарушить их способность поддерживать латентность HSV one.

Культивируйте клетки в течение шести дней при 37 °C, чтобы вирус перешел в состояние латентности. В этот период используйте флуоресцентный микроскоп для мониторинга экспрессии us 11 EGFP в качестве индикатора литической репликации.

Как и ожидалось, в контрольном образце с ложной инфекцией экспрессия GFP должна отсутствовать. S 11 EGFP должен определяться только при наличии инфекции. Лунки положительного контроля без обработки CV указывают на успешное первичное заражение и продуктивную литическую репликацию.

Для оценки реактивации на 14-й день культивирования (DIV 14) осторожно замените среду, содержащую CV, на свежую среду без CV, как и ранее. Направляйте кончик пипетки к стенке лунки, а не к ее дну, чтобы среда плавно стекала на клетки, если это применимо. Введите фармакологические или биологические переменные, такие как LY 2 9 0 0 4 в концентрации 20 micromolar.

В культурах с латентной инфекцией, обработанных A CV, экспрессия GFP не должна обнаруживаться. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в течение пяти-шести дней. Контролируйте живые культуры с помощью флуоресцентного микроскопа для обнаружения нейронов, в которых происходит реактивация.

Частота реактивации рассчитывается путем подсчета количества лунок, содержащих EGFP-положительные нейроны, и выражения этого значения как доли от общего количества исследуемых лунок. На данном рисунке представлен пример, при котором к культурам SCG на поздней стадии инфекции применяли триггерный статин, известный индуктор реактивации. Реактивация отслеживалась и оценивалась с помощью флуоресцентной микроскопии ежедневно в течение пяти дней после введения препарата.

При использовании TSA реактивация достигает 50% от максимума в течение двух дней, а к пятому дню — 60%. Базовая или спонтанная реактивация, представленная группой DMSO, в данном эксперименте составляет примерно 10% для контрольных культур, обработанных препаратом, и обычно варьируется от 5 до 20% при использовании данной системы in vitro. Культуры SCG, зараженные на позднем сроке, также обрабатывали препаратом LY 2 9 0 0 4.

Культуры с реактивацией, индуцированной известным индуктором реактивации LY, сравнивали с культурами, обработанными ингибитором синтеза вирусной ДНК фосфоноацетовым acid (PAA), и с культурами, обработанными обоими соединениями одновременно, как показано здесь. Экспрессия US 11 EGFP подавляется PAA в культурах, в которых реактивация была индуцирована LY 2 9 4 0 0 2, что указывает на зависимость экспрессии US 11 EGFP от репликации вирусной ДНК. При выполнении этой процедуры важно строго соблюдать правила асептики и максимально осторожно обращаться с культурой CG, чтобы избежать усиления спонтанной реактивации, вызванной стрессом или механическими воздействиями. После проведения данной процедуры по созданию латентных инфекций HSV 1 в культурах нейронов можно применять другие методы, такие как нокдаун с помощью shRNA, а также эктопическая экспрессия генов дикого типа и мутантных форм с потерей функции, чтобы охарактеризовать нейронные функции, регулирующие латентность и реактивацию HSV 1.

Не забывайте, что HSV-1 является патогеном человека, требующим мер предосторожности уровня биобезопасности BSL-2. Перед выполнением данной процедуры вы должны ознакомиться с правилами работы в условиях BSL-2. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как создавать культуры SCG для установления латентной инфекции HSV-1 и эффективно индуцировать реактивацию вируса в нейронах.