Культивирование и применение вращающихся стен биореактора полученных 3D эпителиальных клеточных моделях
3 апреля 2012 г.
Вращающейся системе культуры клеток эпителия, который позволяет клеткам расти в физиологических условиях в результате 3-D сотовой формировании совокупного описано. Агрегаты порожденных дисплей В естественных условиях-Подобных характеристик не наблюдается в обычных моделях культуры и служить более точным органотипической модельной системой для множества научных исследований.
В данном нетрадиционном протоколе представлена простая и надежная система культивирования эпителиальных клеток человека для создания органотипических 3D-моделей, воспроизводящих ткани человека in vivo. Сначала эпителиальные клетки выращивают до достижения конфлюэнтного монослоя в колбе для культивирования тканей, затем собирают и объединяют с микроносителями в биореакторе STLV. Вращение STLV на платформе создает условия постоянного свободного падения с низким сдвиговым напряжением жидкости, что позволяет клеткам прикрепляться и расти на микроносителях, формируя клеточные агрегаты через 96 часов и далее примерно каждый день.
Дополняйте среду в SDLV для обеспечения клеточного метаболизма. После формирования агрегатов еженедельно снимайте образцы с помощью световой микроскопии для мониторинга прогресса развития до тех пор, пока не произойдет полное формирование агрегатов и клеточная дифференцировка. Высейте агрегаты для последующего экспериментального анализа и проведения тестов. В конечном итоге эта система позволяет создавать органотипические модельные системы, имитирующие условия in vivo, для проведения множества научных исследований.
Главным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как традиционное культивирование клеток, является то, что эпителиальные клетки дифференцируются и поляризуются в тканеподобные агрегаты, проявляя, таким образом, морфологические и функциональные характеристики, схожие с аутентичной тканью человека. Эта система 3D-моделирования позволяет глубже изучить биологию эпителиальных клеток, взаимодействия между хозяином и патогеном, а также сложные взаимосвязи между типами клеток, которые могут быть введены в систему. Д-р Андреа Рэдки.
Постдок из моей лаборатории продемонстрирует процедуру детоксикации медленно вращающегося латерального сосудистого биореактора. Закройте открытые порты колпачками-заглушками. Заполните STLV 95% ethanol и выдержите в течение 24 часов для уравновешивания.
Удалите этанол, затем заполните устройство стерилизованной дистиллированной водой и инкубируйте в течение 24 часов. Используя инструменты, предоставленные поставщиком, ослабьте все винты и извлеките центральную пробку из STLV. Поместите их в стерилизационный пакет и подвергните автоклавированию при 110 °C в течение 20 минут. Соберите STLV заново и повторите процедуру детоксикации для обеспечения стерильности.
Затем затяните винты STLV. Присоедините предварительно стерилизованный односторонний стопорный кран к каждому порту. Теперь извлеките поршни из шприцев с Luer-Lock объемом 10 мл и 5 мл и положите поршни в обертки.
Для поддержания стерильности прикрутите шприцы к стоп-крану. Добавьте DPBS в шприц объемом 10 мл до полного заполнения STLV и начала заполнения шприца объемом 5 мл. Затем вставьте стерильные поршни в каждый шприц и удалите все остаточные пузырьки из биореактора, поочередно перемещая поршни шприцев.
Закройте краны и закрепите STLV на вращающейся вертикальной платформе. Вращайте в течение минимум 24 часов, чтобы проверить отсутствие утечек в конической пробирке объемом 50 milliliter. Добавьте 15 milliliters DPBS к 250 milligrams микросфер cyto dex и автоклавируйте после охлаждения.
Трижды промойте образец культуральной средой для эпителиальных клеток, чтобы удалить DPBS. Вращайте пробирку круговыми движениями для ресуспендирования бусин. Затем ресуспендируйте бусины в 15 milliliters культуральной среды.
Сначала культивируют 1 × 10⁷ эпителиальных клеток в виде монослоев в колбах для культивирования тканей. Соберите клетки, подсчитайте их количество и определите жизнеспособность клеток с помощью окрашивания трипановым синим. После окрашивания добавьте клетки к подготовленным микросферам.
Промойте коническую пробирку, чтобы убедиться в переносе всех клеток. Затем извлеките DPBS и шприцы из STLV. Также удалите пробку из центрального порта с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
Загрузите суспензию эпителиальных клеток с микросферами в STLV. Промойте коническую пробирку один раз, чтобы перенести все клетки и микросферы. Затем установите заглушку центрального порта на место.
Затем извлеките поршни из шприцев объемом 5 мл и 10 мл и положите их обратно в упаковку. Для поддержания стерильности закройте входные отверстия шприцев открытыми кранами. Заполните STLV средой.
Замените плунжеры и закройте стоп-кран. Теперь уравновесьте свежезасеянную культуру STLV в инкубаторе при 37 °C в течение 30 минут без вращения. После извлечения STLV из инкубатора откройте стоп-кран.
Удалите все пузырьки воздуха с помощью поршней и закройте stop-кран. Затем установите STLV на непрерывное вращение со скоростью 20 RPM в инкубаторе. Через 96–120 часов замените среду, извлекая шприцы и открывая оба stop-крана STLV, чтобы дать бусинам и клеткам осесть.
После оседания слейте около 75% среды через боковой порт с помощью шприцев для выполнения протокола подкормки. Далее продолжайте по мере необходимости восполнять объем среды в зависимости от метаболизма клеток. Также каждые пять-семь дней контролируйте рост и жизнеспособность агрегатов.
Чтобы избежать разрушения агрегатов, используйте наконечник пипетки на 1000 мкл, обрезанный примерно на два сантиметра от кончика и стерилизованный. Осторожно перенесите 200 мкл агрегатов из центрального порта и разделите на две пробирки объемом 1,5 мл. Одну аликвоту используйте для мониторинга жизнеспособности клеток. После отделения клеток от бусин оцените жизнеспособность методом исключения трипанового синего.
Окрашивание для визуализации клеточных агрегатов. Добавьте от 0,5 до 1 мл среды ко второй аликвоте агрегатов объемом 1,5 мл и перенесите в небольшую чашку Петри, используя наконечник пипетки на 1000 мкл с обрезанным концом. Визуализируйте агрегаты.
При использовании инвертированного светового микроскопа для некоторых моделей эпителиальных клеток необходимо перенести агрегаты в одноразовую емкость для улучшения аэрации культуры примерно за одну неделю до сбора агрегатов. Для проведения анализа извлеките шприцы из STLV и слейте около 50% среды через боковой порт. Извлеките центральную пробку и осторожно перелейте все содержимое в коническую пробирку объемом 50 миллилитров через центральный порт.
Промойте STLV дважды пятью миллилитрами среды и объедините промывочные растворы со собранными агрегатами. Затем перенесите агрегаты из 50 миллилитровой конической пробирки в Harv. Через одну неделю осторожно соберите агрегаты для возможных форматов анализа, тестов и исследований; дифференцированные агрегаты эпителия человека были выращены в системе биореактора STLV.
Снимки СЭМ и ПЭМ получены из клеток влагалища человека, выращенных в STLV в течение 39 дней. Обратите внимание, что 3D-агрегаты демонстрируют ультраструктурные особенности, характерные для тканей: микроскладки, инвагинации, внутриклеточные секреторные везикулы и микроворсинки на апикальной поверхности. Снимки конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии 3D-клеток влагалища указывают на экспрессию муцина, а также маркеров, специфичных для эпителиальных клеток и терминальной дифференцировки. Физиологически релевантные фенотипы также служат отличной платформой для оценки токсичности соединений.
Тест МТТ, широко используемый метод оценки жизнеспособности, метаболизма или пролиферации клеток, может быть применен для измерения токсичности различных химических веществ и соединений. В качестве альтернативы токсичность после воздействия исследуемых соединений можно измерить методом исключения трипанового синего. В данном примере после обработки ноноксинолом-9 вагинальные агрегаты продемонстрировали токсический ответ, аналогичный ответу моделей эксплантатов шейки матки, но отличный от профиля монослоев.
3D-агрегаты функционально активны, например, при стимуляции молекулами микробного происхождения, которые распознаются толл-подобными рецепторами. Агрегаты реагируют секрецией провоспалительных цитокинов, включая белок IL6, а также экспрессией транскрипта рецептора прогестерона. В клетках влагалища также может наблюдаться рецептор, реагирующий на гормональную стимуляцию.
3D-агрегаты не только способны реагировать на молекулы патогенов и гормонов, но и могут функционально поддерживать инфекцию вируса простого герпеса 2-го типа. Изображение, полученное с помощью конфокальной микроскопии, демонстрирует инфицирование 3D-агрегатов влагалища HSV 2. Физические и функциональные свойства отдельных клеток внутри агрегатов также могут быть количественно определены с помощью проточной цитометрии; например, с помощью анализа методом проточной цитометрии для измерения поверхностной экспрессии MUC1 на отдельных клетках влагалища.
3D-агрегаты влагалища экспрессировали меньший процент муцина-1 на своей поверхности по сравнению с монослоями после их развития. Данный метод позволил исследователям в области биологии тканей и инфекционных заболеваний изучить структуру и физиологические ответы на стимулы. Использование таких органотипических моделей позволяет более точно воспроизводить биологию человека.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается система ротирующего культивирования клеток, которая позволяет выращивать эпителиальные клетки в физиологических условиях, что приводит к образованию трехмерных клеточных агрегатов. Эти агрегаты обладают характеристиками, схожими с условиями in vivo, что обеспечивает более точную органотипическую модель для различных научных исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Методы культивирования клеток
- Органотипические модели
- Применение в нейронауках
Теоретические основы
- Традиционные модели культивирования часто не способны имитировать условия in vivo.
- Трехмерные клеточные агрегаты позволяют лучше понять особенности поведения тканей.
- Системы вращающихся биореакторов могут улучшить рост и агрегацию клеток.
- Данный метод обеспечивает низкий уровень напряжения сдвига жидкости, что способствует прикреплению клеток.
Цель исследования
- Разработка надежной системы для культивирования эпителиальных клеток человека.
- Создание органотипических 3-D моделей, максимально приближенных к тканям человека.
- Обеспечение возможности проведения последующего экспериментального анализа и тестов.
Используемые методы
- Эпителиальные клетки культивируют до достижения состояния конфлюэнтного монослоя.
- Клетки собирают и объединяют с микроносителями в биореакторе.
- Биореактор вращают для создания условий постоянного свободного падения.
- Среду обновляют для поддержания клеточного метаболизма в процессе формирования агрегатов.
Основные результаты
- Клеточные агрегаты формируются через 96 часов и продолжают развиваться.
- Для мониторинга процесса формирования агрегатов используется световая микроскопия.
- Агрегаты демонстрируют характеристики, сходные с тканями in vivo.
- Данная система подходит для проведения различных научных исследований.
Выводы
- Система ротационного культивирования клеток эффективна для создания органотипических моделей.
- Данный подход позволяет углубить понимание поведения эпителиальных клеток.
- Это открывает новые возможности для исследований в области тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Традиционное 2D-культивирование эпителиальных клеток часто не позволяет предсказать реакции тканей человека, что создает трансляционный разрыв в процессе поиска и разработки лекарственных средств. Биореактор с вращающимся цилиндрическим сосудом позволяет формировать 3D-агрегаты эпителия с морфологией и функциями, близкими к условиям in vivo, что повышает достоверность прогнозов в доклинических моделях. Данная система способствует механистическому снижению рисков, предоставляя релевантную модели заболевания систему для валидации мишеней и разработки методов анализа.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием физиологически релевантной архитектуры и поляризации эпителия.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет воспроизведения плотных контактов, апикально-базальной ориентации и продукции слизи, характерных для условий in vivo.
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность путем моделирования реакций эпителия человека на микробные стимулы и гормональную сигнализацию.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение стандартизированных 3D-агрегатов для количественной оценки секреции цитокинов, экспрессии генов и взаимодействий с патогенами.
- Практическая ценность: позволяет проводить масштабируемый и воспроизводимый скрининг соединений с использованием МТТ-теста, метода исключения трипанового синего и проточной цитометрии.
- Научная ценность: способствует стандартизации анализов для токсикологических исследований и изучения взаимодействий «хозяин-патоген» с измеримыми функциональными показателями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Служит релевантной для патологии системой для оценки токсичности соединений и функции эпителиального барьера перед тестированием in vivo.
- Практическая ценность: Поддерживает согласование трансляционных биомаркеров с помощью количественных показателей, таких как экспрессия муцина и уровни рецепторов прогестерона.
- Научная ценность: Позволяет снизить механистические риски при отборе перспективных соединений путем моделирования истинных ответов тканей человека на стимулы.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
3D-модель эпителия, полученная в биореакторе RWV, интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарств, поддерживая валидацию мишеней посредством фенотипического скрининга и позволяя идентифицировать перспективные соединения с помощью результатов функциональных анализов.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез путем моделирования дифференцировки, поляризации эпителия и его реакций на лиганды TLR и гормоны.
- Скрининг: Позволяет получать готовые для анализа агрегаты с воспроизводимыми сроками формирования (96+ часов) и количественно определяемыми показателями жизнеспособности, секреции и инфицирования.
- Аналитика: Обеспечивает возможность получения мультиплексных данных, включая цитокиновые массивы, вестерн-блоттинг, qPCR и проточную цитометрию для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Связывает фундаментальные открытия с доклиническими исследованиями за счет органотипической структуры и фенотипов, реагирующих на лекарственные препараты.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для генерации моделей эпителия для различных типов клеток и терапевтических направлений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность за счет физиологически релевантной структуры, функций и способности эпителия реагировать на стимулы.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря определенным протоколам агрегации на основе микросфер и восполнения питательных сред.
- Стратегическая ценность: Улучшение принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности при валидации эпителиальных мишеней.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков за счет раннего выявления соединений с благоприятным профилем взаимодействия с эпителием.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы со стерильными биореакторами, сбора клеток и обращения с агрегатами для предотвращения повреждений от сдвига.
- Зависит от доступа к биореакторам RWV (HARV или STLV), микроносителям с коллагеновым покрытием и стандартной инфраструктуре для культивирования клеток.
- Необходима межкомандная стандартизация графиков подачи среды, отбора проб агрегатов и методов оценки жизнеспособности.
- Требуется учет особенностей адаптации при переходе на неэпителиальные типы клеток или системы совместного культивирования.
- Практические ограничения включают длительные сроки культивирования (недели), а также необходимость использования специализированных методов визуализации и биохимических анализов для 3D-анализа.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:55
Preparing the STLV Bioreactor
4:01
Preparing Microcarrier Beads
4:35
Seeding Epithelial Cells and Beads into the STLV Bioreactor
6:45
Culturing, Sampling, and Photo Documentation of Cultures
8:19
Transferring and Harvesting Aggregates
9:27
3D-aggregates and Biology of Human Vaginal Epithelial Cells
11:59
Conclusion
