Комбинаторного синтеза и высокая пропускная способность белка Освобождение от полимерной пленки и наночастицы библиотеки

В этом видео описывается комбинаторный синтез биоразлагаемой полиангидридной пленки и библиотек наночастиц, а также высокопроизводительное обнаружение высвобождения белка из этих библиотек. Во-первых, высокопроизводительные автоматизированные аппараты осаждения, используемые для нанесения разнообразного по составу массива мономеров в стеклянные кюветы. Реакция поликонденсации проводится при температуре 180 градусов Цельсия и 0,3 тор в течение 1,5 часов.

Эти условия реакции специфичны для синтеза полиангидридного полимера C-P-H-S-A. С помощью автоматизированного аппарата для осаждения растворитель и любые компоненты для инкапсуляции наносятся в кюветы, содержащие полимерную библиотеку. Ультразвук может быть введен для обеспечения полного растворения полимера и равномерного диспергирования дополнительных компонентов.

Затем растворенный полимер переносят в пробирку с нерастворителем для изготовления библиотеки наночастиц методом наноосаждения. Наночастицы извлекаются с помощью вакуумной сушки или фильтрации, а затем переносятся в модифицированную хорошо высвобождаемую пластину с 96 отверстиями. Наконец, загруженную белком библиотеку инкубируют в физиологических условиях, а кинетику высвобождения белка оценивают с помощью метода обнаружения флуоресцентного пространства.

В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие кинетику высвобождения белка в зависимости от свойств полимера или условий высвобождения окружающей среды. Основное преимущество этого подхода по сравнению с другими традиционными методами работы по одному образцу за раз заключается в том, что мы можем синтезировать несколько образцов одновременно. Затем эти образцы могут быть проверены с высокой пропускной способностью на наличие белков, полимеров, клеток, полимеров или взаимодействий с полимерами-хозяевами.

Это ускоряет рациональное проектирование и разработку этих биоматериалов для доставки лекарств и тканевой инженерии. Демонстрировать процедуру будет Ла Триша Петерсон, послеоперационная из моей лаборатории. В этом разделе видео используется аппарат высокопроизводительного осаждения Hyatt для осаждения изменяемой по составу библиотеки мономеров после синтеза полимера.

Это устройство используется для изготовления комбинаторной библиотеки заготовок или полимерных пленок или наночастиц, загруженных белком. Автоматизированная платформа состоит из двух программируемых шприцевых насосов и трех линейных приводов, соединенных последовательно с компьютером на компьютере. Программное обеспечение LabVIEW используется для подачи команд на шприцевые насосы и исполнительные механизмы.

Герметичные шприцы объемом 10 куб. см загружаются в шприцевые насосы с металлическими капиллярными трубками, соединенными через фитинги замка приманки, которые дозируют полимерные растворы в стеклянные кюветы. В этой демонстрации будет использована сеиновая кислота или SA с одним параокси-хином Бисса или CPH для создания библиотеки наночастиц, инкапсулирующих сывороточный альбумин Texas Red Boan. Инструкции в этом видео и сопроводительные документы могут быть адаптированы для изготовления и тестирования широкого спектра библиотек полимерных пленок и наночастиц.

Синтез библиотек начинается с растворения каждого мономера и хлороформа в конечной концентрации 25 миллиграммов на миллилитр в стеклянном флаконе. Затем загрузите каждый раствор в герметичный шприц объемом 10 куб. см, отсасывая раствор через конец замка приманки шприца. Удалите все пузырьки воздуха.

Далее прикрепите устойчивый к растворителям замок приманки из нержавеющей стали капиллярной трубки к концу шприца. Закрепите капиллярные трубки в зажимах, прикрепите к кольцевой подставке. Затем поместите конец обеих капиллярных трубок в начальную ветку.

Для осаждения мономеров. Поместите шприцы на программируемые шприцевые насосы и зафиксируйте их в нужном положении в программном обеспечении лабораторного просмотра. Установите линейные приводы в исходное положение в программном обеспечении.

Инициируйте автоматическое осаждение мономеров SA и CPH в стеклянные кюветы по осям x, y и Z. Приводы будут правильно располагать капиллярные трубки в каждой Q, проверять и закачивать в них запрограммированные объемы каждого мономера, создавая композиционно вариативную библиотеку мономеров. Последующее осаждение мономера.

Перенесите библиотеку мономеров в предварительно разогретую вакуумную печь и инкубируйте при температуре 180 градусов Цельсия и 0,3 тура в течение 1,5 часов, чтобы обеспечить конденсационную полимеризацию. После инкубации изготовление полимерной библиотеки завершено. Затем генерируются полимерные наночастицы, загруженные белком.

Смотрите прилагаемый протокол для изготовления библиотеки полимерных пленок с белком для изготовления библиотеки наночастиц с белком. Добавьте в этот раз белок техасского красного бычьего сывороточного альбумина в соответствующий растворитель, который должен быть способен растворять полимерную библиотеку. Здесь используется метиленхлорид в концентрации два миллиграмма на миллилитр.

Наполните шприц объемом 10 куб. см растворителем Texas Red BSA и поместите его в первый шприцевой насос. Затем поместите чистый, пустой двухкубовый шприц во второй шприц-насос поместите трубки, содержащие 15 миллилитров нерастворителя, в данном случае пентан в держатель пробирки, прилегающий к платформе флакона. Затем в лаборатории программного обеспечения для просмотра запустите автоматизированный процесс осаждения растворителя, выбрав программу.

После запуска программы растворитель наносится в кюветы, содержащие полимерную библиотеку, в результате чего концентрация полимера составляет 20 миллиграммов на миллилитр. Когда весь растворитель будет нанесен, дайте ему раствориться в полимере в течение одной-пяти минут. Затем следует дополнительная синдикация, чтобы обеспечить полное растворение полимера и равномерное диспергирование белка.

Затем запустите программу переноса образцов в режиме лабораторного просмотра. Каждый образец растворенного полимера в библиотеке затем извлекается в пустой шприц и дозируется в соответствующую пробирку с нерастворителем в держателе образца. После переноса каждого образца восстановите наночастицы, загруженные белком, поместив библиотеку наночастиц в вакуумную камеру при вакууме 10 миллиметров ртутного столба или используя вакуумную фильтрацию до тех пор, пока растворитель не будет удален.

Чтобы исследовать высвобождение инкапсулированной BSA, начните с полипропиленовой пластины глубокого сварного шва 96, которая была модифицирована путем удаления верхних полдюйма каждой стенки лунки каждой другой прилегающей колонны в пластине. Удаление верхней части каждой скважины между колоннами A и B, C и DENF и GNH обеспечивает поток жидкости между каждой парой смежных скважин при заполнении до полного объемного переноса. Техасские красные стандарты BSA варьируются от 1000 до 10 микрограммов на миллилитр в глубокую 96-луночную пластину.

Они будут использоваться для расчета количества белка, а также будут учитывать гашение флуорохрома, восстанавливать желаемую массу наночастиц в буфере PBS, а затем обрабатывать ультразвуком для равномерного диспергирования частиц. Затем перенесите библиотеку наночастиц в глубокую 96-луночную пластину и подождите, пока образцы осядут на дно луночной пластины. Затем с помощью пипетки медленно заполните все соседние лунки буфером PBS на расстоянии до одной четверти дюйма от верхней части лунки.

В прилегающих скважинах должно быть достаточно буфера, чтобы он свободно тек между скважинами. Затем закройте разжимную пластину крышкой и поместите ее при температуре 37 градусов Цельсия под перемешивание. В течение всего эксперимента с нарастающими временными точками используйте планшетный флуоресцентный сканер с магнитной температурой 9 400 Typhoon для сканирования пластины с использованием соответствующих возбуждающих, лазерных и эмиссионных фильтров.

После сканирования используйте программное обеспечение для количественного определения изображений, чтобы количественно определить количество высвобожденного конъюгированного белка флуорохрома в каждом высвобождении. Техасский красный BSA был инкапсулирован в библиотеку полимерных наночастиц, синтезированных из мономеров SA и CPH, как описано в этом видео, для определения кинетики высвобождения белка в зависимости от химии полимеров. Загруженные белком наночастицы инкубировали при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного месяца, в течение которого были получены флуоресцентные сканирования с нарастающими временными точками для количественной оценки высвобождения белка.

Как показано здесь, этот метод гидропропускной способности был использован для определения кинетики высвобождения Texas Red BSA из библиотеки полиангидридных наночастиц A-C-P-H-S-A. Наблюдались химические зависимые тренды с увеличением скорости высвобождения из пленочных химикатов Сарича. Аналогичные результаты были получены при использовании стандартных анализов количественного определения белка.

В отдельном эксперименте было оценено высвобождение Texas Red BSA из библиотек полиангидридных пленок CPT CPH CPH, как показано здесь, наблюдалась кинетика высвобождения почти нулевого порядка, при этом пленки, богатые CPEG, высвобождали белок наиболее быстро с потенциальными применениями в области медицины в качестве биоразлагаемых устройств доставки лекарств. Эти результаты указывают на то, что желаемый профиль высвобождения терапевтического препарата или антигена вакцины можно контролировать, изменяя химический состав полимера. После этой процедуры были разработаны другие комбинаторные методы для исследования таких областей, как стабильность белка, клеточная токсичность, клеточная активация и биораспределение InVivo.

Эти аспекты важны для рационального проектирования биоматериалов для доставки лекарств и тканевой инженерии. Не забывайте носить надлежащие СИЗ и соблюдайте безопасные лабораторные процедуры на протяжении всего этого протокола.