Протеазы и кислотно-катализируемой маркировки рабочих процессов Применение

В данной презентации представлены рабочие процессы для стабильного изотопного мечения протеолиза белков и синтетических пептидов с использованием воды, обогащенной кислородом 18. Сначала в эксперименте по изучению временной динамики с катализом протеазой субстрат и протеаза инкубируют в присутствии 50% воды, обогащенной кислородом 18, для включения атомов кислорода 18. Затем для протеазы, способной к двойному мечению, проводят повторную инкубацию продуктов расщепления после пищеварения с интересующей протеазой в присутствии 50% воды, обогащенной кислородом 18.

Рабочий процесс EO обеспечивает кислотно-катализируемое включение атомов кислорода 18 в функциональные группы через определенные промежутки времени. Нанесение аликвот реакционных смесей с матрицей на мишени для масс-спектрометрии с последующим сбором данных позволяет получить спектральные графики зависимости от времени реакций расщепления пептидов, а также графики включения кислорода 18. Отдельные виды пептидов, представляющие собой меченые продукты расщепления, отбираются для идентификации последовательности с помощью MSM S. В конечном счете, такие рабочие процессы предоставляют универсальные инструменты для количественных и качественных протеомных исследований.

Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области исследований протеаз, такие как определение скорости, лимитирующих стадий и промежуточных продуктов реакции в сложных протеолитических путях. Протеолитические признаки, выявленные в ходе анализа временного ряда, предоставляют важные сведения о субстратной специфичности. Кроме того, временные параметры данных также содержат кинетическую информацию.

Постдок из моей лаборатории продемонстрирует процедуру. Рабочий процесс анализа кинетики палео-реакций позволяет отслеживать динамику протеолитического расщепления на основе катализируемого протеазой включения oxygen 18. В реакционную смесь объемом 20 µL добавьте исследуемые пептиды в буфер для реакции с протеазой, содержащий воду, обогащенную oxygen 18. Смешайте 0.5 µL реакционной смеси с 0.5 µL матрицы, нанесите каплю на MALDI-мишень Opti-3 84 и оставьте капли растворителя при комнатной температуре до полного высыхания. Тем временем разделите реакционную смесь в две пробирки.

Контроль и образец для пробирки с образцом. Добавьте интересующую протеазу и инкубируйте при рекомендуемой температуре ферментативной реакции. Добавьте в указанные моменты времени.

Отберите аликвоту объемом 0.5 µL, смешайте ее с 0.5 µL матрицы и нанесите каплю на многолуночный планшет. Перейдите к анализу динамики реакции с помощью MALDI-TOF MS, как описано далее в данном рабочем процессе постдигестного мечения. Протеазы, такие как трипсин, катализируют реакцию карбоксильного обмена для включения O18. После проведения протеолиза белков без мечения O18 пропустите продукты расщепления через спин-колонку PepClean C18 для удаления остаточной активности протеаз.

Затем ресуспендируйте образцы в 20 µL буфера для реакции с трипсином, содержащего воду, обогащенную кислородом 18. Отберите аликвоту объемом 0.5 µL и смешайте с равным объемом матрицы. Затем нанесите смесь на мишень для MALDI-анализа Opti Off 3 84 и высушите на воздухе.

Затем разделите реакционную смесь на контрольные пробирки и пробирки с образцом. В пробирки с образцом добавьте трипсин и инкубируйте при 37 °C. Для мониторинга реакции отберите аликвоту объемом 0.5 µL.

Смешайте с 0.5 µL матрицы и нанесите каплю на пластину для MALDI. Проанализируйте динамику этой реакции обмена карбоксильного кислорода с помощью анализа на MALDI-TOF MS. Рабочий процесс IEO по изучению временной зависимости основан на реакциях обмена карбоксильного кислорода в кислых боковых и концевых группах пептидов, катализируемых кислотой.

Сначала инкубируйте 50 нМ отдельных пептидов в воде, обогащенной кислородом-18, в соотношении один к одному, в присутствии или отсутствии 0,1% трихлоруксусной кислоты. Ежедневно в течение 48 дней отбирайте аликвоты реакции объемом 0,5 µL и наносите их вместе с матрицей непосредственно на мишень для MALDI. Регулярно подвергайте мишень для MALDI анализу методом MALDI-TOF MS/MS. Данный раздел подробно описан в сопроводительной рукописи.

Сначала получите масс-спектры в трехкратной повторности в режиме положительных ионов. После калибровки мультиплета и настройки сбора данных масс-спектрометрии выполните одиночные сканирования для получения субспектров. Затем экспортируйте файлы данных масс-спектрометрии из программного обеспечения для сбора данных Explorer серии 4 000.

Затем импортируйте данные в локальную информационную систему, в которой для спектральной обработки и детектирования пиков используется программное обеспечение Mascot Distiller. Выполните деконволюцию изотопных профилей и автоматически определите коэффициенты включения oxygen 18; зафиксируйте коэффициенты включения oxygen 18 как относительный вклад отдельных изотопных форм пептидов в общий изотопный профиль. Отфильтруйте список бинов и выделите как минимум три значения с шириной массы 100 PP m для каждого эксперимента с временным курсом.

Извлеките молекулярные массы всех обнаруженных видов пептидов из соответствующих файлов данных масс-спектрометрии. Теперь с помощью X pacey найдите pep set с допуском по ошибке массы 200 PPM. Сравните список бинов с данными продуктов протеолитического расщепления, предсказанными на основе последовательности субстратного пептида.

Приступите к получению масс-спектров MS/MS для всех значений масс продуктов расщепления, предсказанных инструментом find pep, а также для значений бинов с соответствующим включением кислорода 18. Соберите данные MS/MS из 50 выстрелов в рандомизированном порядке для каждого субспектра (до 40 субспектров на одну точку) и экспортируйте файлы MS/MS. Затем экспортируйте файлы данных MS/MS в систему анализа для детектирования пиков и получения списков пиков MS/MS, связанных с соответствующими данными бенд-МС, для идентификации пептидов.

Установите следующие параметры поиска в поисковом движке Mascot: отсутствие специфичности фермента (no enzyme specificity), допуск по массе иона-предшественника 150 PPM и допуск по массе фрагментного иона 0,2 Дальтона. Выполните поиск по спискам M-S-M-S-P в базе данных Swiss Pro. Идентификация пептидов может быть дополнительно подтверждена с помощью программного обеспечения Data Explorer путем проверки характерных паттернов включения кислорода-18 в фрагментных ионах на спектральных временных графиках.

С помощью макроса экспортируйте файлы данных МС для каждой временной точки реакции из программного обеспечения для исследования данных в формате ASCI. Затем импортируйте эти файлы в программу для анализа данных и построения графиков и отобразите их в виде каскадных диаграмм (waterfall plots) для создания графиков включения кислорода 18 для каждого изгиба. Для продуктов расщепления пептидов извлеките относительный вклад отдельных изотопных форм пептидов для всех временных точек реакции, а затем постройте график зависимости этих значений от времени.

Спектральные графики зависимости от времени, подобные этому, отображают динамику реакций протеолитического расщепления. В данном эксперименте анализируется расщепление биоактивного пептида endo and C эндотелиум-преобразующим ферментом 1. Расположение графиков в виде «водопада» позволяет представить масс-спектры экспериментов с временным ходом для одновременного мониторинга деградации субстрата и появления промежуточных и конечных продуктов.

Продукты расщепления идентифицируются с помощью MSMS и характерных признаков включения кислорода-18 в их изотопные профили. Данный механизм реакции трипсина указывает на то, что сериновые протеазы способствуют включению до двух атомов кислорода-18 в продукты расщепления пептидов. В рабочем процессе маркировки на основе протеаз реакция расщепления пептидной связи приводит к 50%-ному коэффициенту включения одного атома кислорода-18 для вновь образованных продуктов расщепления пептидов; протеазы, такие как трипсин, которые повторно связывают продукты реакции, далее катализируют включение второго атома кислорода-18 посредством реакции обмена карбоксильного кислорода.

В состоянии равновесия метка кислорода 18 распределяется в соотношении один к двум к одному между немаркированными, однократно маркированными и дважды маркированными продуктами. В рабочем процессе маркировки протеолитических концов перед перевариванием расщепления пептидных связей не происходят. Вместо этого включение до двух атомов кислорода 18 основано исключительно на реакции обмена карбоксильного кислорода.

Следовательно, включение кислорода-18 происходит только с теми протеазами, которые повторно связывают продукты расщепления своего пептида. Кислород-18 мечение, катализируемое кислотой, приводит к включению двух атомов кислорода-18 на одну карбоксильную группу. В ходе данного эксперимента множественные сдвиги массы на две дальтона в изотопном профиле ангиотензина I могут быть сопоставлены с поглощением атомов кислорода-18.

Благодаря сочетанию маркировки OPE и масс-спектрометрии высокого разрешения в режиме временного разрешения, метод палео-хронограммы позволяет проводить динамический анализ образования пептидных продуктов. Данный анализ может быть использован для получения стабилизированных топически маркированных пептидов для количественных и качественных протеомных исследований, а также для оценки кинетики образования протопических пептидов.

Временной курс Paleo разработан для оценки протеолитических путей в физиологически значимых условиях. Этот метод заложил основу для нашего недавнего исследования литических процессов в микроокружении рака человека.