Выделение и анализ генома Единого Вирионы использованием "Единое геномики Вирус"

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы выделить отдельные варианы из смешанных консорциумов и секвенировать полученный геномный материал для идентификации вирусов из различных сред без необходимости культивирования. Это достигается путем выделения отдельных вариан с помощью цитометрической сортировки потока на шариках aro. Захват одиночных ионов затем проверяется с помощью конфокальной микроскопии.

Затем геномный материал выделяют из ионов и амплифицируют с помощью амплификации множественного смещения или MDA для получения количества ДНК, необходимого для секвенирования. Наконец, вирусная ДНК секвенируется с использованием высокопроизводительных технологий для создания избыточного покрытия генома вириона, что существенно помогает в сборке и аннотации генома. В конечном счете, биоинформатические методы, направленные на использование подходов субвыборки последовательностей для увеличения размера конуса, позволяют анализировать изолированные воны.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области вирусной экологии, придав геномный контекст огромному пулу аннотированных генов планктона OC, а также сделать возможным открытие новых геномов из различных экосистем. Как правило, люди, которые плохо знакомы с этим методом, могут испытывать трудности, потому что усиление и изоляция одиночных ионов раздвигают границы современных технологий. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы оценивали использование MDA на сообществах планктона Vero и поняли, что можно отсортировать одну вирусную частицу и последовательность и, следовательно, собрать полный вирусный геном из этих сложных сообществ. ЭДТА для смешанной сборки, содержащей Т-4 и лямбда-фаговые частицы, установите F-S-C-P-M-T на 1000, а SSC на 200, чтобы максимизировать отношение сигнал/шум.

После запуска контрольных образцов проведите около 100 микролитров устойчивой вирусной суспензии до 5000 событий. Затем используйте кибер-зеленый и F-S-C-P-M-T графики, чтобы разместить плотные ворота в центре вирусных частиц. Теперь добавьте пять микролитров 1% низкой температуры плавления в буфер TBE, охлажденный до 37 градусов Цельсия, в каждую лунку на предметном стекле микроскопа A-P-T-F-E, а затем загрузите предметное стекло в проточный цитометр, чтобы захватить отсортированные вирусные частицы.

Начните сортировку, захватывая 10 или более вирусных частиц в некоторых лунках, чтобы помочь в обнаружении глубины вирусов во время конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Когда сортировка будет завершена, снимите предметное стекло с проточного цитометра и добавьте в каждую лунку еще пять микролитров низких температур плавления, охлажденных до 37 градусов Цельсия. Встраивание вирусных частиц для одного вариона.

Установите конфокальный лазерный сканирующий микроскоп на 488 нанометров. Затем с помощью функции возбуждения визуализируются встроенные частицы с помощью объектива с увеличенным рабочим расстоянием в 63 раза, чтобы убедиться, что присутствует только одна частица и что несколько вирусов не наслаиваются друг на друга. Затем, как только лунки с одиночными вирусами будут идентифицированы, с помощью бритвенного лезвия удалите нужные бусины агроса со предметного стекла и поместите их в стерильную пробирку для ПЦР.

Поместите трубку в нагревательный блок термоамплификатора, установленного на 94 градуса Цельсия, на три минуты, чтобы удалить вирусную частицу на месте. Затем, после выполнения модифицированного MDA, перенесите геномную ДНК в пробирки эйнора объемом 1,7 миллилитра и добавьте один 10-й объем трехмолярного ацетата натрия в буфер TBE. Чтобы очистить амплифицированный геномный материал, поместите образцы при температуре 55 градусов Цельсия на 10 минут, чтобы растворить арос, а затем переместите пробирки до 42 градусов Цельсия, чтобы снизить температуру перед добавлением фермента. Теперь добавьте по две единицы бета-аазы в каждую пробирку и инкубируйте пробирки в течение двух часов.

Затем добавьте по одному объему буферного насыщенного раствора фенола в каждую пробирку. Энергично перемешайте и центрифугируйте пробирки в течение 15 минут при 3 500 G.At комнатной температуры, перенесите содержащую ДНК НАДОСАДОЧНУЮ жидкость в новую пробирку эйнора объемом 1,7 миллилитров. Затем добавьте в пробирки один объем 100% изопропанола и один микролитр гликосиня и переверните пробирки для перемешивания после повторного центрифугирования пробирок.

На этот раз в течение 60 минут при температуре 28 000 G и четырех градусах Цельсия. Сцедите изопропанол, следя за тем, чтобы не потревожить гранулы, и добавьте 150 микролитров 70% этанола в каждую пробирку. Вращайте трубки в течение 10 минут с частотой 28 000 раз.

G при комнатной температуре. Сцедите этанол на воздух, высушите гранулы ДНК и ресуспендируйте ДНК в соответствующем объеме трис ЭДТА-буфера. Эта трехмерная реконструкция кибер-зеленой, одной окрашенной вирусной частицы в пределах агроскорости демонстрирует, как конфокальная лазерная микроскопия может быть использована для визуализации и подтверждения того, что в каждой лунке получен один вирион.

Здесь показан профильный график относительной флуоресценции окрашенной одиночной вирусной частицы внутри бусины. Эта последняя серия рисунков показывает, как почти весь геном лямбда, за исключением первых пяти пар оснований, был восстановлен для этого репрезентативного вируса. Вот график GC для одного вируса.

Показан идентифицированный геном. На этом рисунке показана карта генома лямбда. Наконец, показано картирование одного генома вируса для репрезентативной изолированной и амплифицированной бактерии фага лямбда.

Ось X показывает положение генома. По оси Y отображается процент покрытия. При попытке выполнить эту процедуру важно использовать стерильную технику и уделить время тому, чтобы избежать загрязнения.

После этой процедуры могут быть использованы другие методы для оценки таксономии выделенных вариан перед секвенированием всего генома. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать одиночные варианы с помощью сортировки клеток, активированных флуоресценцией, конфокальной микроскопии и амплификации всего генома.