Выделение и анализ генома Единого Вирионы использованием "Единое геномики Вирус"

Общая цель данной процедуры заключается в изоляции единичных вирионов из смешанного сообщества и секвенировании полученного геномного материала для идентификации вирусов из различных сред без необходимости их культивирования. Это достигается путем первоначальной изоляции единичных вирионов с помощью сортировки методом проточной цитометрии на агарозные бусины. Затем факт захвата единичного вириона подтверждается с помощью конфокальной микроскопии.

Затем геномный материал выделяют из вирионов и амплифицируют с помощью многократной вытесняющей амплификации (MDA) для получения количества ДНК, необходимого для секвенирования. Наконец, вирусная ДНК секвенируется с использованием высокопроизводительных технологий для обеспечения избыточного покрытия генома вириона, что существенно облегчает сборку и аннотацию генома. В конечном итоге биоинформатические методы, направленные на использование подходов к субдискретизации последовательностей для увеличения размера контигов, позволяют проводить анализ изолированных вирионов.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области вирусной экологии, предоставляя геномный контекст огромному количеству неаннотированных генов вириопланктона, а также позволит обнаруживать новые геномы из различных экосистем. Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку амплификация и изоляция единичных вирионов находятся на пределе возможностей современных технологий. Идея этого метода возникла у нас при оценке использования MDA для сообществ вириопланктона, когда мы поняли, что можно отсортировать одну вирусную частицу, секвенировать и, следовательно, собрать полный вирусный геном из таких сложных сообществ. Для сортировки вирусов используйте проточный цитометр, оснащенный специальными фотоэлектронными умножителями прямого светорассеяния (FSCPMT). Начните с разбавления вирусных частиц в Трис-ЭДТА, отфильтрованном через мембрану с порами 0.1 мкм. Для смешанной совокупности, содержащей частицы фагов T4 и лямбда, установите значение FSCPMT на 1000, а SSC на 200, чтобы максимально увеличить соотношение сигнал/шум.

После анализа контрольных образцов пропустите около 100 µL окрашенной вирусной суспензии до достижения общего количества в 5 000 событий. Затем с помощью диаграмм sybr green one и FSCPMT установите узкий гейт в центре популяции вирусных частиц. Теперь добавьте по 5 µL 1% низкоплавкого агарозы в ТБЕ-буфере, охлажденном до 37 °C, в каждую лунку на ПТФЭ-предметном стекле, после чего установите стекло в проточный цитометр для сбора отсортированных вирусных частиц.

Начните сортировку, регистрируя 10 или более событий вирусных частиц в некоторых лунках, чтобы облегчить определение глубины залегания вирусов при конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. По завершении сортировки извлеките предметное стекло из проточного цитометра и добавьте в каждую лунку с закрепленными вирусными частицами еще 5 µL низкоплавящего агарозы, охлажденной до 37 °C. Для одиночных вирионов установите возбуждение конфокального лазерного сканирующего микроскопа на 488 nm. Затем визуализируйте закрепленные частицы, используя объектив с большим рабочим расстоянием и увеличением 63x, чтобы убедиться в наличии только одной частицы и отсутствии наслоения нескольких вирусов друг на друга. После идентификации лунок с одиночными вирусами с помощью лезвия бритвы извлеките нужные агарозные бусины с предметного стекла и поместите их в стерильную ПЦР-пробирку.

Поместите пробирку в термоблок амплификатора, установленного на 94 °C, на три минуты для лизиса вирусных частиц in-situ. После проведения модифицированного MDA перенесите геномную ДНК в пробирки Eppendorf объемом 1,7 мл и добавьте 1/10 объема 3 M ацетата натрия в буфере TBE для очистки амплифицированного геномного материала. Выдержите образцы при 55 °C в течение 10 минут для растворения агарозы, затем переместите пробирки при 42 °C для снижения температуры перед добавлением фермента. Добавьте по две единицы бета-агаразы в каждую пробирку и инкубируйте пробирки в течение двух часов.

Затем добавьте в каждую пробирку один объем буферизированного насыщенного раствора фенола. Тщательно перемешайте и центрифугируйте пробирки в течение 15 минут при 3, 500 ×g при комнатной температуре. Перенесите содержащие ДНК супернатанты в новые пробирки Eppendorf объемом 1,7 мл. Далее добавьте в пробирки один объем 100% изопропанола и один микролит glyco-blue, затем переверните пробирки для перемешивания. После повторного центрифугирования, на этот раз в течение 60 минут при 28, 000 ×g и 4 °C, слейте изопропанол, стараясь не повредить осадок, и добавьте в каждую пробирку 150 мкл 70% этанола. Центрифугируйте пробирки в течение 10 минут при 28, 000 ×g при комнатной температуре. Слейте этанол, высушите осадок ДНК на воздухе и ресуспендируйте ДНК в соответствующем объеме Tris-EDTA буфера. Эта трехмерная реконструкция вирусной частицы, окрашенной SYBR Green I и находящейся внутри агарозной бусины, демонстрирует, как конфокальная лазерная микроскопия может быть использована для визуализации и подтверждения того, что в каждой лунке после захвата и встраивания в агарозу получен один вирион; на врезке показана вирусная частица при большем увеличении.

Здесь представлен профиль относительной флуоресценции окрашенной одиночной вирусной частицы внутри агарозной микросферы. Эта заключительная серия рисунков демонстрирует, что для данного репрезентативного вируса был восстановлен почти весь геном Lambda, за исключением первых пяти пар оснований. Здесь показан график GC-состава для идентифицированного генома одиночного вируса. На этом рисунке представлена карта генома lambda. Наконец, показано картирование генома одиночного вируса для репрезентативного изолированного и амплифицированного бактериофага lambda. Ось X показывает положение в геноме. Ось Y показывает процент покрытия.

При выполнении данной процедуры крайне важно соблюдать правила стерильности и уделять достаточное время тому, чтобы избежать контаминации. После завершения этой процедуры могут быть применены другие методы для оценки таксономии изолированных вирионов перед полногеномным секвенированием. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как изолировать единичные вирионы с помощью сортировки клеток с флуоресцентной активацией, конфокальной микроскопии и амплификации всего генома.