Affinity осадков активного Rho-GEFs Использование GST с метками Мутант Rho белка (GST-RhoA (G17A)) из эпителиальных клеточные лизаты

Общая цель данной процедуры заключается в отслеживании активации RO специфическими факторами обмена G-D-P-G-T-P (gafs) в культивируемых клетках с использованием мутантного слитого белка RO A GST, который обладает высоким сродством к активированным gs. Это достигается путем предварительного получения мутантного белка row с GST-меткой в бактериях. Затем проводится очистка белка row A GST, иммобилизованного на микросферах.

Затем с помощью электрофореза в ПААГ-SDS оценивают чистоту и концентрацию белка GST RO A. В завершение подготавливают клеточный лизат и проводят анализ осаждения GEF с использованием белка GST RO A. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие повышенное осаждение активированного GS в обработанных клетках, что подтверждается вестерн-блот-анализом осажденных белков со специфическими антителами к GF и количественным определением с помощью денситометрии.

Данный метод может помочь ответить на ряд важных вопросов в области изучения ГТФаз, например, каким образом регулируются многочисленные факторы обмена ГДФ/ГТФ специфично для конкретного сигнала и как координируется их активность? Как правило, лица, впервые применяющие данный метод, поначалу сталкиваются с трудностями, так как белок GST RO G 17 A относительно нестабилен и может подвергаться деградации в процессе подготовки. Также важно помнить о необходимости быстрого и последовательного проведения анализа осаждения GF. Эту процедуру продемонстрирует Пфайзер Вахид, магистрант моей лаборатории, при трансформации e coli.

Быстро добавьте 1 µL pX-rowA-G17A ДНК в концентрации 25–50 ng/µL в 50 µL компетентных клеток DH5α, находящихся в ледяной бане. Перемешайте содержимое пробирки легким постукиванием и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Подвергните клетки тепловому шоку при 42 °C в течение 45 секунд, после чего снова поместите их на лед на две минуты.

Добавьте 900 µL среды SOC и культивируйте в течение одного часа при 37 °C с перемешиванием. С помощью стерильной пастеровской пипетки с загнутым концом распределите от 50 до 100 µL трансформированных бактерий по предварительно подготовленной чашке с LB-агаром и пенициллином. Инкубируйте чашку в перевернутом виде (дном вверх) в инкубаторе при 37 °C в течение пяти минут, после чего переверните её и оставьте для роста на ночь.

Выберите хорошо изолированную колонию трансформированных бактерий и используйте ее для инокуляции 50 миллилитров среды LB с ампициллином. Культивируйте бактерии в течение ночи при 37 °C с перемешиванием. Когда культура достигнет максимальной плотности, разбавьте ее 450 миллилитрами среды LB с ампициллином и инкубируйте еще 30 минут. При 37 °C индуцируйте экспрессию целевого белка в бактериях, добавив 500 микролитров 100 миллимолярного IPTG в 500 миллилитров культуры.

Снизьте температуру до 22–24 °C и культивируйте в течение примерно 16 часов. Центрифугируйте культуру при 3 600 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Заморозьте осадок минимум на один час или, предпочтительнее, на ночь при температуре -80 °C.

После приготовления 200 миллилитров лизирующего буфера согласно письменному протоколу, приготовьте модифицированный лизирующий буфер, добавив в 10 миллилитров основного буфера 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF и одну таблетку ингибитора протеаз, работая на льду. Добавьте 10 миллилитров модифицированного лизирующего буфера к осадкам Thor и тщательно ресуспендируйте путем пипетирования и перемешивания на вортексе. Проведите соникацию суспензии на льду в течение одной минуты при настройке четыре с 50% импульсом.

Центрифугируйте соникат лизата при 15 000–20 000 ×g в течение 15 минут при температуре 4 °C и перенесите осветленный соникат в стерильную пробирку объемом 15 мл с крышкой. Подготовьте сферические бусины с глутатионом, осторожно перемешав 75% суспензию, и с помощью наконечника с широким отверстием перенесите 335 µL в пробирку объемом 15 мл. Добавьте 10 мл холодного PBS и центрифугируйте при 500 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C.

Удалите супернатант. Добавьте 1 mL буфера для лизиса плюс к гранулам и снова центрифугируйте. Снова удалите супернатант и добавьте буфер для лизиса.

Кроме того, для приготовления 50% суспензии смешайте две порции по 50 µL уравновешенной суспензии гранул с подготовленным супернатантом. Инкубируйте при перемешивании при 4 °C в течение 45 минут. Приготовьте HBS plus, добавив в 100 mL буфера HBS 5 mM хлорида магния и 1 mM DTT; центрифугируйте супернатант и гранулы при 500 ×g в течение пяти минут при 4 °C.

Удалите супернатант и дважды промойте гранулы 10 миллилитрами лизисного буфера plus, а затем дважды — 10 миллилитрами HBS plus. После финальной промывки приготовьте 50%-ную суспензию, ресуспендировав гранулы в HBS plus с добавлением ингибитора протеаз. Разбавьте 10 микролитров итоговой подготовки гранул двухкратным объемом буфера для образцов LAMB с содержанием β-меркаптоэтанола.

Затем приготовьте три стандартных образца BSA, смешав 10 µL, 5 µL и 2,5 µL стокового раствора BSA с концентрацией 2 mg/mL с 10 µL буфера Лаэммли.

Прокипятите образцы в течение пяти минут, затем кратковременно центрифугируйте и разделяйте их совместно с маркером молекулярной массы на 10% SDS-полиакриламидном геле; после окрашивания и дестайнинга геля оцените количество GST row A G 17 A, используя стандарты BSA в качестве эталона. Перенесите аликвоты равного объема бусин, содержащих примерно 10–15 µg белка, в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Для подготовки к анализу GF pull-down вырастите используемые клетки до состояния конфлюэнтности в чашках диаметром 10 см и подвергните их сывороточному голоданию в течение как минимум трех часов перед проведением анализа.

Непосредственно перед началом анализа. Приготовьте лизирующий буфер с добавлением ингибиторов протеаз, работая на льду. Удалите культуральную среду из чашек и промойте их ледяным раствором HBS.

Удалите весь HBS и добавьте по 700 µL буфера для лизиса (Lysis Buffer plus) в каждую лунку. Равномерно распределите раствор по всей поверхности планшета.

Затем соскоблите и соберите лизаты в пронумерованные пробирки объемом 1,5 мл. Центрифугируйте при 15,000 ×g в течение одной минуты при температуре 4 °C. Сохраните супернатант для анализа; если количество клеток в каждой лунке было эквивалентным, возьмите по 30 µL каждого супернатанта и смешайте с 30 µL двухкратного восстанавливающего буфера для образцов.

Затем прокипятите и поместите на лед. Добавьте оставшиеся супернатанты к аликвотам бусин GST row a G 17 A и инкубируйте при вращении в течение 45 минут при 4 °C. Центрифугируйте бусины при 6 800 ×g в течение 10 секунд при 4 °C.

Удалите супернатант и трижды промойте гранулы лизирующим буфером. С помощью шприца объемом 1 мл с иглой 30-го калибра полностью удалите финальный раствор для промывки и добавьте 20 µL двухкратного восстанавливающего буфера для образцов. Кипятите образцы в течение пяти минут, центрифугируйте для осаждения гранул и проведите электрофорез общих клеточных лизатов и образцов осажденного белка в SDS-PAGE геле с процентом акриламида, соответствующим размеру изучаемого GF.

Наконец, проведите вестерн-блоттинг для определения результатов соответствующего анализа GF. Здесь показано определение активации фактора обмена GFH1. Белок row A G 17 A захватывает некоторое количество GFH1 из лизатов контрольных клеток, что указывает на наличие базальной активности GFH1.

Однако количество осадка увеличилось в клетках, обработанных воспалительным цитокином фактором некроза опухоли альфа, что согласуется с представлением о том, что TNF alpha активирует G FH one. Важно отметить, что в общем клеточном лизате обнаруживается схожее количество gfh one в контрольном и обработанном образцах; это говорит о том, что обработка не изменила уровни G FH one и что количество исходного материала, использованного в анализе, было равным. При адаптации данной процедуры важно хранить белок GSE RO G 17 A и клеточные лизаты на льду.

Проводите анализ GF быстро и последовательно, используя подходящие положительные контроли, которые позволят выявить недостоверные результаты и устранить возникшие проблемы.