Клинические испытания и удаления спинного мозга у мышей на боковой амиотрофический склероз (ALS)

Здравствуйте, меня зовут Лар Тернер. Я посток в отделении неврологии Университета Ингема, Германия. Привет, меня зовут Лин Гунда.

Я студент-медик и выполняю свою дипломную работу в этой лаборатории. Сегодня мы продемонстрируем клиническое тестирование SOD1 G93A — модели бокового амиотрофического склероза на мышах. Кроме того, мы покажем тест двигательной функции с помощью так называемого роторного теста, а также еще один тест двигательной функции с использованием подвесного провода, чтобы в дальнейшем провести иммунологический анализ.

После функционального тестирования мышей линии a s необходимо провести процедуру извлечения спинного мозга, нерва STIC и икроножной мышцы. Мы детально продемонстрируем эти хирургические манипуляции, а в конце представим некоторые репрезентативные результаты иммунологического анализа. Итак, начнем с клинического тестирования.

Это свободно передвигающаяся мышь дикого типа MOE, у которой отсутствуют какие-либо клинические симптомы, такие как мышечный тремор или парезы, согласно нашей системе клинической классификации. Это соответствовало бы четырем баллам. А это трансгенная мышь ALS moe.

На ранней стадии заболевания наблюдается сильный тремор правой задней конечности, что соответствует баллу 3 по шкале SCORE. Выраженные нарушения походки позволяют классифицировать данное животное с баллом 2. Влачение хотя бы одной задней конечности классифицируется как клинический балл 1. В тесте с подвешиванием за проволоку оценивается грубая мышечная сила ребер. Каждую мышь помещают на специально изготовленную проволоку и осторожно переворачивают вверх ногами над подложкой, покрытой соломой.

После трех последовательных тренировок продолжительностью не менее 180 секунд измеряли латентный период до падения. Каждой мыши предоставлялось до трех попыток удержаться за перевернутую крышку в течение максимум 180 секунд, и фиксировался самый длительный интервал. По сравнению с контрольной мышью (белый провод) справа, трансгенная мышь с амилоидными бляшками слева очень слабая и падает с крышки, не достигнув максимального времени.

Аппарат с вращающимся стержнем (ротор-род) используется для измерения моторной координации, равновесия и способности к моторному обучению. Хороший результат требует высокой степени сенсомоторной координации. Устройство состоит из управляемого компьютером вращающегося шпинделя с электроприводом и пяти дорожек для пяти мышей.

Ошибки мышей регистрируются автоматически по воздействию давления на нижнюю пластиковую пластину. После трех последовательных тренировок продолжительностью не менее 180 с при постоянной скорости 15 об/мин измеряется время, в течение которого животное может удерживаться на вращающемся стержне. Для каждого животного проводится три попытки, и фиксируется наибольшее время удержания без падения.

Здоровая мышь дикого типа слева без труда бежит по вращающемуся стержню. Напротив, трансгенная мышь a s mo справа испытывает серьезные трудности даже с тем, чтобы просто удерживаться на стержне, и через некоторое время соскальзывает с него, что видно при наблюдении сзади. Вы наблюдаете выраженные нарушения координации движений у мыши retre слева.

По сравнению со здоровой мышью линии wire tap, данное животное не способно поддерживать скорость вращающегося стержня и не может совершать толчки вверх конечностями HIN. Для проведения иммунохимического анализа спинного мозга животных необходимо подвергнуть эвтаназии. Крайне важно всегда строго соблюдать местные правила проведения экспериментов на животных.

В данном контексте, в этом предельно упрощенном обзоре позвоночного столба и окружающих его тканей, представлены основные анатомические структуры. Мы поместим животное на вентральную сторону и приступим к подготовке мышц со стороны дорсального отдела. После удаления мышечной ткани мы получим доступ к позвоночному столбу, внутри которого находится спинной мозг.

После того как животное было умерщвлено и подвергнуто перфузии раствором параформальдегида, можно приступить к извлечению спинного мозга. Животное помещают на операционный стол, фиксируя конечности по бокам, чтобы обеспечить доступ к спине мыши. Шерсть животного смачивают для того, чтобы она плотнее прилегала к телу, что облегчает последующий разрез кожи.

Для этого используется острый скальпель. Осторожно растяните кожу в обе стороны. Для облегчения разреза необходимо подготовить мышцу ноги.

Также необходимо произвести разрез кожи. После завершения разреза кожу аккуратно оттягивают в сторону. С помощью пинцета удаляют мышцы конечностей и седалищный нерв, после чего приступают к обнажению спинного мозга, переместив животное на новый операционный стол.

Теперь можно легко идентифицировать шейный отдел черепа, мышцы и позвоночный столб. После идентификации всех этих структур можно переходить к следующему этапу. Необходимо удалить мышцы шеи и связку nucha.

Будьте осторожны, чтобы не сделать слишком глубокий разрез и не повредить позвоночный столб. На следующем этапе паравертебральные мышцы удаляются полностью для обнажения позвоночного столба. Для получения доступа к позвоночнику необходимо выполнить несколько эктомий.

Мы начинаем с шейного отдела позвоночного столба, включая атланто-затылочный сустав. Для проведения ламинэктомии необходимо рассечь дугу позвонка, чтобы иметь возможность удалить все отростки позвонка от тела позвонка. Как было объяснено ранее, ламинэктомия начинается с рассечения дужек позвонков.

Затем можно оттянуть кожу. Снова будьте осторожны, чтобы не повредить спинной мозг, так как необходимо удалить еще несколько дуг позвонков. Весьма удобно использовать угловатые ножницы и рассекать сразу несколько дуг позвонков с обеих сторон.

Затем потяните за дорсальные отростки, чтобы полностью удалить дуги позвонков и сделать крупный план. Видно, что ножницы необходимо осторожно ввести максимально латерально по бокам спинномозгового канала. Оставшиеся латеральные части позвоночника следует удалить, чтобы облегчить последующее полное извлечение спинного мозга.

Анатомическими ориентирами спинного мозга являются так называемые шейная и поясничная расширения. После завершения эктомии всего спинного мозга убедитесь, что вы также пересекли все вентральные корешки спинного мозга и освободили его от твердой мозговой оболочки. Затем производится пересечение шейного отдела спинного мозга.

Удаление продолжается в краниальном направлении. Прикасайтесь к спинному мозгу крайне осторожно, чтобы не повредить ткань, так как это может создать серьезные ограничения для последующего иммунохимического анализа. Извлечение спинного мозга продолжается на уровне грудного отдела и далее переходит в поясничный отдел.

На этот раз разрез делается сбоку от конского хвоста. Теперь мы можем полностью высвободить его. Здесь вы видите спинной мозг, помещенный непосредственно рядом с его первоначальным расположением в колонке RAL.

В завершение образец помещают в раствор для постфиксации Paraform Hyde. В качестве классического примера иммуногистохимического анализа спинного мозга можно использовать антитела к холинацетилтрансферазе для идентификации мотонейронов в передних рогах спинного мозга. Здесь представлено большое количество мотонейронов у здорового животного дикого типа.

Напротив, у трансгенного животного с БАС на терминальной стадии наблюдается значительно меньшее количество мотонейронов в передних рогах. Посмотрев эту видеостатью, вы должны были освоить основы клинического обследования мышиной модели бокового амиотрофического склероза SODG 93.

Были продемонстрированы два теста двигательного поведения: тест на роторе и тест на удержании на проволоке. Они предоставляют хорошие возможности для оценки базовой моторной функции. Данные тесты просты в выполнении, обладают высокой чувствительностью при выявлении двигательного дефицита и эффективны с точки зрения затрат времени.

Основная часть данного видео посвящена демонстрации методики подготовки спинного мозга. Данный метод, разумеется, может быть применен к любой другой модели заболевания у мышей и является важным этапом для последующего иммунохимического анализа патологии заболевания в спинном мозге. Благодарим за просмотр.

Надеемся, что эта видеостатья будет полезна в ваших будущих экспериментах.