Клинические испытания и удаления спинного мозга у мышей на боковой амиотрофический склероз (ALS)

Здравствуйте, меня зовут Лар Тернер. Я постдок на кафедре неврологии Университета Ингема, Германия. Привет, меня зовут Лин Гунда.

Я студент медицинского факультета и выполняю свою дипломную работу в этой лаборатории. Сегодня мы продемонстрируем клиническое тестирование SOD1 G93A — модели бокового амиотрофического склероза у мышей. Кроме того, мы покажем тест двигательных функций с использованием так называемого ротор-теста, а также другой тест двигательных функций — тест на удержание за подвешенную проволоку — для последующего проведения иммунологического анализа.

После функционального тестирования мышей линии a s необходимо провести процедуру по извлечению спинного мозга, STIC-нерва и икроножной мышцы. Мы намерены детально продемонстрировать данные хирургические манипуляции, а в конце представить некоторые примеры результатов иммунологического анализа. Итак, начнем с клинического тестирования.

Это свободно передвигающаяся мышь дикого типа MOE, которая не проявляет никаких клинических симптомов, таких как мышечный тремор или парезы, согласно нашей системе клинической классификации. Это соответствовало бы четырем баллам. А это трансгенная мышь ALS moe.

На ранней стадии заболевания наблюдается сильный тремор правой задней конечности, что соответствует баллу 3 по шкале SCORE. Выраженные нарушения походки позволяют классифицировать это животное как имеющее балл 2. Подволакивание хотя бы одной задней конечности классифицируется как клинический балл 1. В тесте с подвешиванием за проволоку оценивается грубая мышечная сила ребер. Каждую мышь помещают на специально изготовленную проволоку и осторожно переворачивают вверх дном над подстилкой из соломы.

После трех последовательных тренировок продолжительностью не менее 180 секунд измеряли латентный период до падения. Каждой мыши предоставлялось до трех попыток удержаться за перевернутую крышку в течение максимум 180 секунд, и фиксировался самый длительный интервал. По сравнению с мышью дикого типа (белая проволока) в правой части, трансгенная мышь с бляшками в левой части очень слаба и падает с крышки, не достигая максимального времени.

Аппарат с вращающимся стержнем (Rotor rod) используется для измерения моторной координации, равновесия и способности к моторному обучению. Хороший результат требует высокой степени сенсомоторной координации. Устройство состоит из управляемого компьютером вращающегося шпинделя с электроприводом и пяти дорожек для пяти мышей.

Ошибки мышей регистрируются автоматически по давлению на нижнюю пластиковую пластину. После трех последовательных тренировок продолжительностью не менее 180 секунд при постоянной скорости 15 оборотов в минуту измеряется время, в течение которого животное может удерживаться на вращающемся роторе. Каждое животное проходит три испытания, и фиксируется наибольшее время удержания без падения.

Здоровая мышь дикого типа слева без труда бежит по вращающемуся стержню. Напротив, трансгенная мышь a s mo справа испытывает серьезные трудности даже с тем, чтобы просто удержаться на стержне, и спустя некоторое время соскальзывает с него, что видно при наблюдении сзади. Вы видите выраженные нарушения координации движений у мыши left retre.

По сравнению со здоровой мышью с перетянутым нервом, данная мышь не успевает за скоростью вращения стержня ротора и не может отталкиваться конечностями HIN. Для проведения иммунохимического анализа спинного мозга животных необходимо подвергнуть эвтаназии. Крайне важно всегда строго соблюдать местные правила проведения экспериментов на животных.

В данном контексте, в этом очень упрощенном обзоре позвоночного столба и окружающих его тканей, представлены основные анатомические структуры. Мы поместим животное на вентральную сторону и приступим к препарированию мышц из дорсального кармана. После удаления мышечной ткани мы получим доступ к позвоночному столбу, внутри которого расположен спинной мозг.

После того как животное было умерщвлено и перфузировано раствором параформальдегида, можно приступить к извлечению спинного мозга. Животное помещают на операционный стол, фиксируя конечности по бокам, чтобы обеспечить доступ к дорсальной стороне мыши. Животное смачивают водой, чтобы прижать шерсть и облегчить последующий разрез кожи.

Для этого используется острый скальпель. Необходимо аккуратно растянуть кожу в обе стороны. Для облегчения разреза следует подготовить мышцу ноги.

Также необходимо произвести разрез кожи. После завершения разреза кожу осторожно отводят в сторону. С помощью пинцета удалив мышцы конечности и седалищный нерв, мы продолжаем доступ к спинному мозгу, переложив животное на новый операционный стол.

Теперь можно легко идентифицировать затылочную область, мышцы и позвоночный столб. После идентификации всех этих структур можно переходить к следующему этапу. Необходимо удалить мышцы шеи и нухальную связку.

Будьте осторожны, чтобы не сделать слишком глубокий разрез и не повредить позвоночный столб. На следующем этапе паравертебральные мышцы полностью удаляются для обнажения позвоночника. Для получения доступа к позвоночному столбу необходимо выполнить несколько эксцизий.

Мы начинаем с шейного отдела позвоночника, включая атланто-затылочный сустав. Для выполнения ламинэктомии необходимо рассечь дугу позвонка, чтобы иметь возможность удалить все отростки позвонка из тела позвонка. Как было сказано ранее, ламинэктомия начинается с рассечения дуг позвонков.

Затем можно отодвинуть кожу. Снова будьте осторожны, чтобы не повредить спинной мозг, так как необходимо удалить еще много дуг. Довольно полезно использовать угловые ножницы и рассекать сразу несколько дуг позвонков с обеих сторон.

Затем потяните за дорсальные отростки, чтобы полностью удалить дужки позвонков, и рассмотрите изображение крупным планом. Видно, что ножницы необходимо осторожно ввести максимально латерально, сбоку от спинномозгового канала. Оставшиеся латеральные части позвоночного столба следует удалить, чтобы облегчить последующее полное извлечение спинного мозга.

Анатомическими ориентирами спинного мозга являются так называемые шейное и поясничное утолщения. Завершив эктомию всего спинного мозга, убедитесь, что вы также пересекли все вентральные корешки спинного мозга и освободили его от твердой мозговой оболочки. Затем производится разрез шейного отдела спинного мозга.

Продолжите удаление в краниальном направлении. Прикасайтесь к спинному мозгу очень осторожно, чтобы не повредить ткань, так как это может привести к серьезным ограничениям при последующем иммуногистохимическом анализе. Далее удаление спинного мозга продолжается на уровне грудного отдела и переходит к поясничному отделу.

Затем производится повторный разрез, на этот раз сбоку от конского хвоста. Теперь мы можем полностью освободить его. Здесь вы видите спинной мозг, расположенный непосредственно рядом с его первоначальным местом в колонке RAL.

В завершение образец помещают в раствор Параформ Hyde для постфиксации. В качестве классического примера иммуногистохимического анализа спинного мозга можно использовать антитела к холиноацетилтрансферазе для идентификации мотонейронов в передних рогах спинного мозга. Здесь представлено большое количество мотонейронов у здорового животного дикого типа.

Напротив, у трансгенного животного с БАС на терминальной стадии в переднем роге наблюдается значительно меньшее количество мотонейронов. Посмотрев эту видеостатью, вы должны были ознакомиться с основами клинического обследования модели бокового атрофического склероза на мышах SODG 93.

Были продемонстрированы два теста моторного поведения: тест на роторе и тест на удержании на проволоке. Они обеспечивают хорошую возможность оценки базовых моторных функций. Эти тесты просты в исполнении, обладают высокой чувствительностью при выявлении моторного дефицита и эффективны с точки зрения затрат времени.

Основная часть данного видео посвящена демонстрации техники подготовки спинного мозга. Этот метод, разумеется, может быть применен к любой другой модели заболевания у мышей и является важным этапом для последующего иммунохимического анализа патологии заболевания в спинном мозге. Благодарим за просмотр.

Мы надеемся, что эта видеостатья окажется полезной для ваших будущих экспериментов.