В режиме реального времени Digital Imaging лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия при ишемии-реперфузии (ИРИ) в мышцах Кремастер Крысы

Прижизненная микроскопия микроциркуляции в мышце m. cremaster является удобным методом для изучения ишемии и реперфузионного повреждения поперечнополосатой мышечной ткани. В данном пошаговом протоколе мы описываем процесс проведения анестезии с контролем дыхания и надлежащим мониторингом с помощью артериальной каннюляции, что позволяет поддерживать стабильный уровень наркоза у животного в течение длительного времени. Мы демонстрируем способ каннюляции яремной вены, а затем описываем подготовку мышцы m. cremaster в виде тонкого плоского листа для достижения высокого оптического разрешения.

Мы представляем протокол визуализации лейкоцитов при ишемически-реперфузионном повреждении, который был успешно внедрен в наших лабораториях. Данная модель может быть использована для анализа окислительного стресса при исследовании ишемически-реперфузионного повреждения.

Реперфузионное повреждение при ишемии играет роль в развитии широкого спектра патологических состояний, таких как инфаркт миокарда, ишемия кишечника, а также возникает после трансплантации и сердечно-сосудистых операций. Гиперперфузия ранее ишемизированной ткани, будучи необходимой для предотвращения необратимого повреждения тканей, вызывает избыточное воспаление пораженной ткани, что сопровождается выработкой активных форм кислорода, активацией системы комплемента и повышением микрососудистой проницаемости. Активация лейкоцитов является одним из основных факторов в патологическом каскаде воспалительного повреждения тканей во время реперфузии.

В данной работе мы предлагаем использовать прижизненную микроскопию пост капиллярных венул в качестве удобного метода анализа активации лейкоцитов при ишемически-реперфузионном повреждении. Далее мы иллюстрируем распространенные ошибки и приводим полезные советы, которые позволят читателю в полной мере оценить данный метод и безопасно его реализовать. После получения одобрения комитета по этике и анастезии самцов крыс с массой тела от 120 до 180 г, поместите крысу в плексигласовый бокс и подайте 2–3% по объему изофлурана через испаритель изофлурана.

Как только будет достигнут соответствующий уровень анестезии, крысу взвешивают и выбривают шерсть в вентральной области шеи. Поместите животное в положение на спине на грелку для поддержания температуры тела на уровне 37 °C и подавайте изофлуран в концентрации 2% по объему с помощью силиконовой маски. Следующие этапы подготовки лучше всего выполнять с использованием хирургического микроскопа.

Выполните горизонтальный разрез кожи длиной два сантиметра в области яремной вырезки грудины SRAs. Сместите слюнные железы латерально. Теперь перед вами мышцы передней поверхности шеи.

Осторожно раздвиньте ткани по срединной линии и найдите трахею. Обнажите один-два сантиметра трахеи и с помощью микропинцета приподнимите её снизу. Затем SL примерно посередине вентральной стороны трахеи введите трубку калибра 14G в качестве трахеальной трубки в нижнюю часть трахеи, которая была предварительно подключена к аппарату ИВЛ для животных.

Затем можно установить контроль дыхания по объему с частотой от 35 до 45 вдохов в минуту. Дыхательный объем составляет от 4.5 до 5 мл, а концентрация изофлурана при канюляции сонной артерии — от 1.5 до 2% по объему. Правую грудино-язычную мышцу отделяют путем тупой диссекции.

Чтобы найти сонную артерию, осторожно отделите блуждающий нерв от сонной артерии и зафиксируйте артерию микропинцетом Anki, чтобы остановить кровоток из сердца. Наложите две лигатуры из шовного материала под сонной артерией относительно сердца: дистальную лигатуру завяжите плотно, а проксимальную — слабо вокруг сонной артерии. Наложение второй проксимальной лигатуры предотвратит кровотечение после извлечения микропинцета. С помощью микроножниц сделайте небольшой надрез в сонной артерии между двумя лигатурами. Вставьте полиэтиленовый катетер, заполненный физиологическим раствором и подключенный к преобразователю давления.

Извлеките микропинцет и продвиньте катетер глубже в артерию. Проводите периодический анализ газов артериальной крови с помощью газоанализатора и поддерживайте pH крови в физиологических пределах для внутривенного введения флуоресцентных красителей или других интересующих препаратов. Сфокусируйте хирургический микроскоп на области левой яремной вены и, используя пинцеты в обеих руках, рассеките тонкую фасцию, чтобы обнажить яремную вену.

Зафиксируйте вену с помощью углового микропинцета, чтобы остановить кровоток. Используя пинцет, пропустите под яремной веной два отрезка шовного материала равной длины аналогично канюляции сонной артерии, сделайте небольшой разрез в яремной вене и введите полиэтиленовый катетер, предварительно промытый раствором для клеточных линий. Проведите катетер в направлении сердца и затяните лигатуру, расположенную ближе к сердцу.

Вокруг вены и катетера мы используем алюминиевую платформу для визуализации семенного канатика (Stage four cremasteric imaging), которая быстро принимает заданную температуру нагревательной подушки. Первый разрез делается на коже и наружной семенной фасции над мошонкой на самом дистальном конце, после чего следует осторожное расширение подкожного пространства с помощью тонких ножниц. Как только ткани обнажаются, их увлажняют предварительно подогретым физиологическим раствором.

Соединительную ткань между наружной семенной фасцией и m. cremaster осторожно удаляют, чтобы освободить мышцы кремастера от окружающих тканей. Непрерывная перфузия во время диссекции гидратирует ткань, что облегчает визуализацию и удаление; например, дистальный конец m. cremaster фиксируют и слегка растягивают внутри дистального конца семенного мешка с вентральной стороны, удлиняя разрез проксимально. С помощью микрохирургических ножниц осторожно коагулируют кровоточащие сосуды вдоль линий разреза.

Используя термический коагулятор, раздвинутую мышцу кремастера укладывают плоско на алюминиевый пьедестал, при этом семенник остается соединенным с подлежащими эпидидимисами тонкими связками, включая небольшую артерию и вену. С помощью коагулятора перекрывают сосуды и рассекают соединительные связки между дискальной и кремастерной тканями. Осторожно задвигают изолированный семенник обратно в паховый канал.

В дополнение к первой фиксации, которая включает четыре стежка ткани и осторожное разведение нитей, радиально распластайте кремастерную ткань на алюминиевой подложке. Для настройки суперфузии расположите два конца полиэтиленового катетера рядом с кремастерной тканью. С помощью шприца нанесите линию вазелина вокруг кремастерной мышцы, чтобы создать жидкостную камеру.

Поместите квадратное покровное стекло поверх ткани и плотно прижмите края к линии вазелина. Теперь кремастерная ткань готова к микроскопической визуализации. Базовая схема для интравитального исследования может варьироваться.

Для проведения EP-ламинирования мы используем intravital эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный светодиодным источником света с длиной волны 470 nanometer. С помощью объектива с иммерсией в воду мы достигаем увеличения примерно 800 x, при этом запись наблюдений осуществляется с помощью цифровой камеры высокого разрешения. Эпифлуоресцентную визуализацию следует проводить в темной комнате.

Для маркировки лейкоцитов внутривенно через яремный катетер введите rumine six J в концентрации 0,4 mg/kg массы тела. Для наблюдения выберите посткапиллярный сосуд. Диаметр сосуда должен составлять от 20 до 60 µm, а кровоток должен быть достаточным.

Перед наступлением ишемии дайте ткани стабилизироваться в течение 30 минут. После этого проведите 30-секундную запись для установления базовых значений роллинга и адгезии лейкоцитов. С помощью аппликационного пинцета осторожно закрепите зажим для сосудов Bemer на самом проксимальном конце обнаженной ткани кремастерной мышцы.

Снимите зажим с сосуда через 30 минут ишемии. Последующие записи можно проводить на протяжении всего периода реперфузии. Для количественной оценки роллинга лейкоцитов определите виртуальную линию, пересекающую сосуд вертикально, которая будет неизменной для всех записей.

Вручную подсчитайте количество роллирующих лейкоцитов, пересекающих линию в течение 30 секунд. Для количественного определения адгезированных лейкоцитов выберите фиксированный участок сосуда длиной 200 микрометр, который будет использоваться во всех записях.

Подсчитайте количество четко видимых лейкоцитов, которые остаются неподвижными в течение 30 секунд. Репрезентативные результаты представлены в письменном протоколе. Несмотря на то, что ишемически-реперфузионное повреждение затрагивает различные системы органов, в данной работе мы описываем метод анализа взаимодействия лейкоцитов с эндотелием при реперфузионном повреждении скелетной мышечной ткани.

Таким образом, это особенно актуально для операций по пересадке лоскутов, поскольку предполагается, что посишемическое повреждение тканей других органов сопровождается теми же воспалительными механизмами. Описанный метод может быть использован для получения фундаментальных представлений о патологических механизмах ишемического повреждения при слиянии. Индукция ишемии в мышце, поднимающей семенник, легко выполняется и точно отражает клинически значимые условия, такие как операции со свободным лоскутом.

Кроме того, можно легко применить такие модификации, как холодная или теплая ишемия, либо хромостерическую суперфузию веществами, влияющими на воспаление. Интраоральная инъекция может быть предпочтительным методом, когда лечение требуется за несколько часов или дней до регистрации данных.