Нано-FEM: Белка Локализация с использованием фото-активированного микроскопии локализации и электронная микроскопия

Общая цель следующего эксперимента заключается в локализации белков на электронных микрофотографиях с помощью корреляционной флуоресцентной и электронной микроскопии. Данный метод, известный как nano FEM, используется для локализации белков в C. elegans. Сначала трансгенный червь, экспрессирующий гистон TD-eos, заливается в пластик и подвергается сечении.

Каждый срез визуализируют с помощью как фотоактивируемой локализационной микроскопии (PALM), так и сканирующей электронной микроскопии. Два микрофотоснимка каждого среза совмещают в Photoshop с помощью реперных меток. Коррелятивное изображение демонстрирует локализацию молекул гистонов в ядре.

Таким образом, основным преимуществом метода, который мы опишем сегодня, является то, что вместо иммуноэлектронной микроскопии мы используем генетически кодируемые флуоресцентные белки, благодаря чему каждый белок связан с флуоресцентным белком. При использовании иммуноэлектронной микроскопии многие антитела могут вступать в реакцию с пластиком, что приводит к несовместимости, а если реакция не происходит, антитела не способны проникнуть глубоко в срез, где расположены антигены.

С помощью флуоресцентных белков каждый белок помечается флуорофором. Сегодня Сигэ Вби продемонстрирует эту методику. Следующая процедура будет показана на трансгенных нематодах, экспрессирующих гистоны, помеченные флуоресцентным белком TDE os.

Для данной демонстрации мы будем использовать бактерии в качестве криопротектора, однако для замораживания sea elegance можно также использовать 20% BSA. За один час до проведения криозамещения заполните автоматический аппарат для криозамещения или устройство FS жидким азотом. Также заранее подготовьте необходимые фиксаторы согласно инструкциям в сопроводительном документе, разлейте фиксаторы по аликвотам объемом 1 мл в криопробирки и храните их в жидком азоте до использования.

С помощью кисти соберите животных с бактериального газона и перенесите их в 100-микронный контейнер для образцов. Слегка переполните чашку, чтобы исключить появление пузырьков воздуха. После этого поместите контейнер с образцом в зажим криостата высокого давления для замораживания. Затем немедленно переместите образец в ванну с жидким азотом, расположенную рядом с камерой замораживания.

Затем с помощью пинцета и вспомогательного инструмента перенесите образец в криопробирку с фиксаторами. Убедитесь, что образец постоянно находится в жидком азоте. Повторите эту процедуру для каждого образца, после чего поместите все криопробирки в блок FS.

После размещения всех криопробирок в установке FS запустите программу. Протокол замораживания и обработки представлен на данной диаграмме. Во время начальной инкубации при температуре -90 °C витрифицированный лед заменяется фиксатором в ацетоне.

Затем, по мере повышения температуры образца, фиксатор в жидком ацетоне создает поперечные связи в образце для сохранения его структуры. Когда температура в блоке FS достигнет -60 °C, поместите в FS сцинтилляционные флаконы, содержащие 20 мл 95% ацетона, для их охлаждения. Затем, когда температура достигнет -50 °C, с помощью пипетки Пастера с наконечником P 200 удалите фиксатор и добавьте примерно 1 мл предварительно охлажденного 95% ацетона к каждому образцу желчи.

Повторяйте этот процесс каждые 20 минут в течение двух часов. Кроме того, во время инкубации при -50 °C поместите в камеру заморозки сцинтилляционный флакон, содержащий 20 мл 0,1% раствора урацилацетата в 95% ацетоне, для предварительного охлаждения до -50 °C. Затем после финальной промывки ацетоном добавьте примерно 1 мл раствора урацилацетата в каждый флакон, чтобы окрасить образец для усиления контрастности мембран.

Если программа была приостановлена, запустите ее снова. Когда температура достигнет −40 °C, поместите сцинтилляционные флаконы, содержащие 95% ethanol, в камеру FS. Когда температура достигнет −30 °C, с помощью пастернаж pipette заменяйте urinal acetate на 95% ethanol каждые 20 минут в течение двух часов.

На этом этапе важно использовать этанол, так как смола не будет полимеризоваться в присутствии ацетона. В следующей части протокола образцы заключают в пластик, пока они находятся при температуре -30 °C. В FS замените 95% ethanol предварительно охлажденной 30% смолой гликольметакрилата или GMA в 95% ethanol; через три-пять часов замените 30% GMA на 70% GMA; через четыре-шесть часов удалите 70% GMA и инкубируйте образцы в 97% GMA в течение ночи.

Поэтапное увеличение концентрации ГМА обеспечивает проникновение среды в ткани. Обратите внимание, что поскольку в смолу ГМА добавляется 3% воды, 97% ГМА не разбавляется. На следующий день, используя этанол, перенесите образцы в форму для заливки в А FS с помощью пипетки Пастера; поместите образцы в форму для заливки, затем трижды замените 97% ГМА на свежеприготовленный ГМА в течение шести часов при температуре минус 30 градусов цельсия.

После третьей замены осторожно промокните бактериальную матрицу, чтобы отделить образец от криопротектора. В вентиляционном флаконе добавьте инициатор N,N-диметиланилин к 97% GMA. Количество добавляемого инициатора составляет 1,5 µL на 1 mL GMA; немедленно добавьте раствор GMA в каждую форму для заливки и разместите животных в форме так, чтобы они были распределены равномерно.

Перезапустите программу так, чтобы температура поднялась до -20 °C. Хотя смола полимеризуется быстро, в течение одного часа, оставьте пластик для отверждения на ночь при температуре -20 °C, чтобы убедиться в его полной полимеризации.

После отверждения пластика храните образец в вакуумном пакете, заполненном газообразным азотом, при температуре -20 °C. Срезы образца, залитого в GMA, следует выполнять согласно описанию в сопроводительном документе по фотоактивируемой локализационной микроскопии или PALM-визуализации. Микроскоп должен быть настроен с использованием EMCCD-камеры, охлажденной до -70 °C или ниже.

С помощью пипетки нанесите примерно 50 µL раствора золотых частиц размером 100 нм с концентрацией 1 × 10¹⁰ частиц/мл на образец, предназначенный для визуализации. Накройте образцы черным защитным кожухом и оставьте раствор на покровном стекле на 30 секунд. Чтобы удалить раствор золота, сдвиньте его к краю покровного стекла и впитайте салфеткой Kimwipe.

Затем нанесите вакуумную смазку на круглый держатель покровного стекла и вставьте покровное стекло. Нанесите иммерсионное масло на нижнюю сторону стекла. Аккуратно поместите его непосредственно над образцом.

Вставьте держатель образца в слот на предметном столике микроскопа и отрегулируйте его положение так, чтобы он был плотно зафиксирован, а срезы располагались точно по центру над объективом. Будьте предельно осторожны, чтобы не задеть объективы. Затем, используя освещение в светлом поле, найдите срезы с помощью объектива с увеличением 10x.

Затем переключитесь на объектив с увеличением 100 x и сфокусируйтесь на образце. При необходимости перейдите на флуоресцентное освещение, используя лазер с длиной волны 488 нанометров при интенсивности 10%. Подождите пять минут для выравнивания температуры образца. Затем определите области с наиболее интенсивной флуоресценцией и настройте их в фокус.

Переключите лазеры на 561 нм и увеличьте интенсивность до 100%. Для выжигания фоновой автофлуоресценции подвергайте образец фотовыгоранию в течение примерно двух минут. Если в процессе выжигания фокус сместится, подождите пять минут, прежде чем корректировать фокус и делать снимки. По завершении выжигания включите лазер с длиной волны 405 нм и установите его на минимальную интенсивность.

Начните сбор изображений со скоростью 20 кадров в секунду. Соберите достаточное количество кадров для достижения целей данного эксперимента. Для определения локализации 584 белков гистонов в ядре снимают от 5 000 до 6 000 кадров.

После сбора 5 000 кадров все молекулы идентифицируются и картируются с помощью программного обеспечения для обработки изображений. Итоговое флуоресцентное изображение, так называемое изображение «some turf», представляет собой композицию всей флуоресценции, зафиксированной камерой. Напротив, изображение «palm» отображает OID каждого флуоресцентного пятна и указывает только на местоположение каждого белка.

Перед проведением СЕМ-визуализации окрасьте срезы 2,5% раствором уранилацетата в воде в течение четырех минут. Тщательно промойте срезы от уранилацетата фильтрованной водой milli QE. После высыхания срезов используйте распылитель для нанесения углеродного покрытия на покровное стекло до достижения достаточно темного цвета.

Нанесите углеродную проводящую ленту на край покровного стекла с одного конца и на металлический столик с другого, чтобы электроны, накапливающиеся на поверхности покровного стекла, заземлялись. Поместите покровное стекло в камеру СЭМ и найдите образец в микроскопе. Сделайте снимок образца при низком увеличении, затем увеличьте интересующую область и получите изображения при высоком увеличении.

Повторяйте этот процесс с новым срезом до тех пор, пока не будут получены изображения всех срезов. Затем необходимо совместить изображения, полученные с помощью пальмового микроскопа и электронного микроскопа (ЭМ). Для этого сначала откройте полученные СЭМ-изображения в Photoshop.

Создайте новое окно с размерами 5 000 на 5 000 пикселей и разрешением 300 пикселей на дюйм. Скопируйте изображение СЭМ с низким увеличением в новое окно. Используйте команду «Свободное трансформирование» (free transform) в меню «Редактировать» (edit), чтобы масштабировать изображение так, чтобы оно заполняло все окно.

Затем скопируйте СЭМ-изображения с большим увеличением, масштабируйте и трансформируйте их по мере необходимости. Выберите поворот изображения в выпадающем меню инструментов и отразите суммарное изображение поверхности по горизонтали. Скопируйте и вставьте суммарное изображение поверхности на новый слой.

Используйте команду «Свободное трансформирование» (free transform) в меню «Редактирование» (edit), чтобы масштабировать изображение так, чтобы оно было примерно того же размера, что и электронная микрофотография с малым увеличением. Затем поверните изображение, если это необходимо, чтобы совместить флуоресценцию золотых частиц с соответствующими структурами, визуализированными с помощью СЭМ. Далее скопируйте изображение ладони на новый слой и примените те же преобразования, чтобы получить изображение с более высоким увеличением.

Приблизьте интересующую область и скопируйте изображение ладони из этой области. Вставьте изображение в СЭМ-снимок с более высоким разрешением для презентации. К изображению ладони следует применить градиент прозрачности таким образом, чтобы прозрачным стал только черный фон, но не сигналы ладони.

Скопируйте изображение преобразованной ладони на новый слой. Выделите сигналы ладони, исключив фон, используя функцию «Цветовой диапазон» (color range) в выпадающем меню выделения. Затем выберите пиксель фона в качестве образца и активируйте опцию «Инверсия» (invert).

Вырежьте нужные сигналы ладони и вставьте их на новый слой. Примените прозрачность к фоновому слою и установите ее на уровне 10%. Это позволяет визуализировать сигналы ладони, делая фон прозрачным без потери интенсивности. Гистоновый белок.

His11-меченый TD eos стабильно экспрессировался в нематоде c elgan; трансгенные животные обрабатывали и визуализировали согласно протоколу, описанному в данном видео. Флуоресцентные и электронные микрофотографии были получены из одного и того же среза. Золотые наночастицы, видимые как на флуоресцентных, так и на электронных микрофотографиях, затем использовались для совмещения двух изображений.

Здесь мы увеличиваем область рядом с верхним краем микрофотографии. Как видно здесь, видны субклеточные детали, такие как ядро.

Можно наблюдать ядро, ядерные поры и эндоплазматический ретикулум. Однако меченые молекулы гистонов локализованы исключительно в ядре, но не в цитоплазме. Таким образом, коррелятивная ПАМ- и электронная микроскопия позволяют определить локализацию белков с максимально возможным разрешением. После выполнения этой процедуры можно взять данные срезы с распределением белков и объединить их с помощью массивной томографии, чтобы создать трехмерную структуру, демонстрирующую распределение белков в клетке.

И помните, что при использовании тетраоксида осмия следует соблюдать осторожность, так как это очень опасное химическое вещество, и вам всегда следует работать в перчатках.