Нано-FEM: Белка Локализация с использованием фото-активированного микроскопии локализации и электронная микроскопия

Общая цель данного эксперимента — локализация белков и электронных микрофотографий с помощью коррелированной флуоресценции и электронной микроскопии. Здесь. Этот метод, известный как нано-МКЭ, используется для локализации белков в C. elgan. Во-первых, трансгенный червь, экспрессирующий гистон TD eos, встраивается в пластик и разрезается.

Каждый срез визуализируется с помощью фотоактивированной локализионной микроскопии или ладонной и сканирующей электронной микроскопии. Две микрофотографии для каждого раздела выравниваются с помощью реперных маркеров в Photoshop. Коррелятивное изображение показывает локализацию молекул гистонов в ядре

Итак, основное преимущество метода, который мы собираемся описать сегодня, заключается в том, что вместо иммунофермента мы используем генетически кодируемые полы, так что каждый белок связан с флуоресцентным белком. При работе с иммуноэм многие антитела не могут взаимодействовать с пластиком. Это просто несовместимо, а если это так, антитела не способны проникнуть глубоко в участок, где находятся антигены.

При использовании флуоресцентных белков каждый белок помечается фтором. Поэтому сегодня shige wbi будет демонстрировать эту технику. Следующая процедура будет продемонстрирована с использованием трансгенных нематод, экспрессирующих гистоны, меченные флуоресцентным белком TDE os.

Для этой демонстрации мы будем использовать бактерии в качестве защиты от крика, но вы также можете использовать 20% BSA для замораживания морской элегантности. За час до замораживания заполните автоматический сублимационный наполнитель или устройство ФС жидким азотом. Также заранее подготовьте необходимые фиксаторы в соответствии с инструкциями в сопроводительном документе, храните фиксаторы в одном миллилитре, аликвоты в криопробирках и поместите их в жидкий азот до тех пор, пока они не будут использованы.

С помощью кисти зачерпните животных с лужайки от бактерий и перенесите их в контейнер для образцов размером 100 микрон Слегка переполните чашку, чтобы убедиться, что в ней нет вентиляционных отверстий. При хранении поместите чашку для образцов в якорь морозильной камеры высокого давления, чтобы заморозить ее. Затем сразу же перенесите образец в ванну с жидким азотом рядом с морозильной камерой.

Затем, используя все и пару щипцов, перенесите образец в криопробирку, содержащую фиксаторы. Убедитесь, что образец все время находится под воздействием жидкого азота. Повторите этот процесс для каждого образца, затем перенесите все криопробирки в установку FS.

После того, как все криопробирки будут помещены в установку FS, запустите программу. Протокол замораживания и обработки показан на этой схеме. Во время начальной инкубации при температуре минус 90 градусов Цельсия стекловидный лед заменяется фиксатором в ацетоне.

Затем, по мере повышения температуры образца, фиксатор в жидком ацетоне сшивает образец для сохранения структуры. Когда температура в установке ФС достигает минус 60 градусов по Цельсию, поместите в ФС сцинтилляционные флаконы, содержащие 20 миллилитров 95% ацетона, для их охлаждения. Затем, когда температура достигнет минус 50 градусов по Цельсию, с помощью пастеровской пипетки с наконечником P 200 удалите фиксатор и добавьте около одного миллилитра предварительно охлажденного 95% ацетона в каждый образец. Желчь.

Повторяйте этот процесс каждые 20 минут в течение двух часов. Кроме того, во время инкубации при температуре минус 50 градусов Цельсия поместите сцинтилляционный флакон, содержащий 20 миллилитров 0,1% ацетата писсуара в 95% ацетона, в камеру FS для предварительного охлаждения до минус 50 градусов Цельсия. Затем после окончательного промывания ацетоном добавьте около одного миллилитра раствора ацетата писсуара в каждый флакон, чтобы окрасить образец для усиления контраста мембраны.

Если программа была поставлена на паузу, перезапустите ее. Когда температура достигнет минус 40 градусов по Цельсию, поместите в камеру ФС сцинтилляционные флаконы, содержащие 95% этанола. Когда температура достигнет минус 30 градусов по Цельсию, используйте пастбищную пипетку, чтобы заменить ацетат мочеприемника на 95% этанол каждые 20 минут в течение двух часов.

На этом этапе важно использовать этанол, так как смола не полимеризуется в присутствии ацетона. В следующей части протокола образцы встраиваются в пластик, в то время как их температура составляет минус 30 градусов по Цельсию. В ФС замените 95% этанол на предварительно охлажденную 30% гликольметакрилатную смолу или GMA в 95% этаноле через три-пять часов, замените 30% GMA на 70% GMA через четыре-шесть часов, удалите 70% GMA и инкубируйте образцы в 97% GMA в течение ночи.

Ступенчатое увеличение концентрации ГМА способствует проникновению среды в ткани. Обратите внимание, что поскольку в смолу GMA добавляется 3% воды, 97% GMA не разбавляется. На следующий день с этанолом перенесите образцы в форму для встраивания в A FS с помощью пипетки Пастера, поместите образцы в форму для встраивания, затем замените 97% GMA на свежеприготовленный GMA три раза в течение шести часов при температуре минус 30 градусов Цельсия.

После третьего обмена постучите по бактериальной матрице, чтобы отделить образец от криопротектора. Добавьте инициатор nn диметилудин в 97% GMA в вентиляционный флакон. Количество добавляемого инициатора составляет 1,5 микролитра на один миллилитр GMA, немедленно добавьте раствор GMA в каждую встраиваемую форму и расположите животных в форме так, чтобы животные были равномерно расположены друг от друга.

Перезапустите программу, чтобы температура повысилась до минус 20 градусов по Цельсию. Хотя смола быстро полимеризуется в течение одного часа, дайте пластику застыть в течение ночи при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы быть уверенным в том, что он основательно полимеризуется.

После того, как пластик затвердеет, храните образец в вакуумном пакете, наполненном газообразным азотом, при температуре минус 20 градусов Цельсия. Затем следует выполнить срез внедренного GMA образца, как описано в сопроводительном документе, для фотоактивированной локализации, микроскопии или визуализации ладонью. Система микроскопа должна быть настроена на камеру E-M-C-C-D с температурой минус 70 градусов Цельсия или ниже.

С помощью пипетки нанесите около 50 микролитров 100-нанометровых частиц золота в соотношении от 10 до 10-10 частиц на миллилитр в раствор для изображения. Наденьте на образцы черную чехол-крышку и дайте раствору постоять на крышке в течение 30 секунд. Чтобы удалить золотой раствор, продуйте его до края крышки и впитайте раствор салфеткой.

Затем нанесите вакуумную смазку на круглый держатель крышки и вставьте крышку. Нанесите иммерсионное масло на нижнюю сторону крышки. Проведите прямо под образцом.

Вставьте держатель образца в прорезь на предметном столике микроскопа и отрегулируйте его таким образом, чтобы максимально плотно и по центру срезы над объективом. Будьте особенно осторожны, чтобы не касаться целей. Затем, используя светлопольное освещение, найдите секции с помощью объектива с 10-кратным увеличением.

Затем переключитесь на объектив со 100-кратным увеличением и сфокусируйтесь на образце. При необходимости переключитесь на флуоресцентное освещение с помощью лазера 488 нанометров с интенсивностью 10%Подождите пять минут, чтобы температура образца уравновесилась. Затем определите области с самой яркой флуоресценцией и сфокусируйте их.

Переключите лазеры на 561 нанометр и увеличьте интенсивность до 100%.Чтобы отбелить фоновую автофлуоресценцию, отбеливайте образец примерно на две минуты. Если фокус изменяется во время обесцвечивания, подождите пять минут, прежде чем настроить фокус и сделать съемку. Когда отбеливание будет завершено, активируйте лазер с яркостью 405 нанометров и установите его на самую низкую интенсивность.

Начните собирать изображения со скоростью 20 кадров в секунду. Соберите достаточно кадров для достижения цели эксперимента здесь. От 5 000 до 6 000 кадров берутся для определения локализации 584 белков гистонов в ядре.

После того, как собрано 5 000 кадров, все молекулы идентифицируются и картируются программным обеспечением для визуализации. Окончательное флуоресцентное изображение или так называемое изображение некоторого газона представляет собой комбинацию всех флуоресцентных изображений, обнаруженных камерой. В отличие от этого, изображение ладони отображает OID каждого флуоресцентного пятна и указывает только на то, где находится каждый белок.

Перед СЭМ-визуализацией окрашивают срезы с помощью 2,5% ацетата мочеприемника в воде в течение четырех минут. Смойте писсуар, тщательно ацетайте фильтрованной водой milli QE. После того, как срезы высохнут, используйте распылитель для нанесения углеродного покрытия на покровное стекло, пока оно не станет достаточно темным.

Наклейте углеродную проводящую ленту на край покровного стекла с одного конца и на металлическую заглушку с другого конца, чтобы электроны, накапливающиеся на поверхности покровного стекла, были заземлены. Установите защитное стекло в камеру SEM и найдите образец на микроскопе. Сделайте изображение образца с малым увеличением, затем увеличьте интересующую область и получите изображения с большим увеличением.

Повторяйте этот процесс с новым разделом, пока все разделы не будут изображены. Далее необходимо выровнять изображение ладони и ЭМ. Чтобы сделать это, сначала откройте полученные изображения SEM в Photoshop.

Создайте новое окно с размерами 5 000 на 5 000 пикселей и разрешением 300 пикселей на дюйм. Скопируйте изображение SEM с увеличением загрузки в новое окно. Используйте команду свободного преобразования в меню редактирования, чтобы масштабировать изображение так, чтобы оно занимало все окно.

Затем скопируйте изображения SEM с большим увеличением, масштабируйте и преобразуйте по мере необходимости. Выберите поворот изображения в строке выпадающего меню изображения и переверните изображение суммы газона горизонтально. Скопируйте и вставьте изображение с сумой газона в новый слой.

Используйте команду свободного преобразования в меню редактирования, чтобы масштабировать изображение так, чтобы оно было примерно такого же размера, как электронная микрофотография с малым увеличением. Затем поверните изображение по мере необходимости, чтобы сопоставить флуоресценцию частиц золота с соответствующими структурами, визуализированными в СЭМ. Далее, скопируйте изображение ладони в новый слой и примените ту же трансформацию, чтобы извлечь изображение с большим увеличением.

Увеличьте интересующую область и скопируйте изображение ладони из этой области. Вставьте изображение в изображение SEM с более высоким разрешением для презентации. Градиентная прозрачность должна быть применена к изображению ладони, чтобы прозрачным стал только черный фон, но не сигналы ладони.

Скопируйте изображение с трансформируемой ладонью в новый слой. Выберите сигналы ладони, но не фон, используя цветовой диапазон в раскрывающемся меню выбора. Затем выберите пиксель фона в качестве образца и включите опцию инвертирования.

Вырежьте нужные ладонные сигналы и вставьте их на новый слой. Примените прозрачность к фоновому слою и установите его на 10%Это позволяет визуализировать сигналы ладони, делая фон прозрачным без ущерба для интенсивности. Белок гистон.

Его 11 меченых TD eos были стабильно экспрессированы у нематоды c elgan, а трансгенные животные были обработаны и визуализированы с использованием протокола, описанного в этом видео. Из того же участка были получены пальмовые и электронные микрофотографии. Наночастицы золота, которые появляются как на флуоресцентных, так и на электронных микрофотографиях, были затем использованы для выравнивания двух изображений.

Здесь мы увеличиваем область в верхней части микрофотографии. Что видно здесь. Субклеточные детали, такие как ядро.

Можно наблюдать ядро, ядерные поры Nu и эндоплазматический ретикулум. Тем не менее, помеченные молекулы гистонов локализованы исключительно в ядре, но не в ядре Как и ожидалось, коррелятивная пальмовая и электронная микроскопия, таким образом, позволяет локализовать белок с самым высоким разрешением. После выполнения этой процедуры можно взять эти участки с распределением белков и сложить их с помощью матричной томографии, чтобы можно было создать трехмерную структуру, которая показывает, где белки распределены в клетке.

И помните, что при использовании тетраоксида осмия это очень опасное, опасное химическое вещество, и вы всегда должны надевать перчатки.