Генерация Мыши, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель этой процедуры заключается в получении взрослых мышей из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или I ПСК, путем комплементации тетраплоидных эмбрионов. Это достигается путем первого прибытия. I ПСК из эмбриональных фибробластов мышей с использованием лентивирусов, несущих OCT 4, SOX 2, KLA 4 и CMIC и дополняющих среду вальпроевой кислотой или VPA.

После того, как ИКК генерируются, они характеризуются иммуноокрашиванием, подсчетом хромосом и формированием тела эмбриона. Следующим шагом является получение реципиентного тетраплоидного бласт-ассистента путем слияния и культивирования in vitro. Впоследствии IPSC вводят тетраплоидный бласт-ассист, а комплементарный бласт-ассист трансплантируют самкам-реципиентам для гестации.

На заключительном этапе доношенные животные доставляются путем кесарева сечения и суррогатным матерям. Таким образом, можно контролировать постнатальное развитие. В конечном итоге, если это жизнеспособно, то получаются доношенные животные.

Линия IPSC для анализа считается полностью плюрипотентной. Основное преимущество этого метода перед другими методами получения I PSC заключается в том, что наш метод воспроизводимо генерирует полностью плюрипотентные IPS-клеточные линии. Эти методы будут полезны для исследователей, желающих получить полностью плюрипотентные клеточные линии IPS для конкретных последующих применений, таких как анализы дифференцировки in vitro.

Далее поступило поколение всех мышей IPSC. Использование telo комплементации может служить полезным средством для определения генетической и эпигенетической стабильности различных клеточных линий. Микроманипуляции, связанные с комплементацией тетраплоидного эмбриона, технически сложны.

Может потребоваться несколько месяцев, чтобы кто-то овладел навыками В методах, разработанных с помощью этого метода, требуются те же условия культивирования, которые используются в традиционных экспериментах по нацеливанию гена ESL. Через 24 часа после трансфекции HEC 2 9 3 Т-клеток лентивирусом. Удалите питательную среду и замените ее 25 миллилитрами свежей предтеплой техники.

Среда возвращает трансфицированный гекс в инкубатор в течение 24 часов, через 48 часов после трансфекции HEC 2 9 3 Т-клетки с лентивирусом собирают питательную среду, содержащую частицы лентивируса, из трансфицированных клеток. Удалите твердые частицы из среды, содержащей вирус, путем центрифугирования при давлении 3000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем сконцентрируйте вирус с помощью ультрацентрифугирования в подушке из 20% сахарозы в течение двух часов при 112 000 G при четырех градусах Цельсия.

Осторожно сцедите его в контейнер для отходов для обеззараживания, не потревожив вирусную гранулу. Ресуспендируйте вирусную гранулу в 0,4 миллилитра мышиной эмбриональной фибробластной среды и запечатайте пробирку. Затем осторожно покачивайте его при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15-30 минут.

Храните вирусные частицы и одноразовые аликвоты при температуре минус 80 градусов Цельсия. Линии образуются из эмбриональных фибробластов мыши, или метамфетаминовых клеток. Как только колонии IPSC обретут яркую преломляющую четко очерченную границу и будут содержать от 30 до 50 клеток, они будут готовы к ручному отбору и расширению в качестве независимых линий IPSC.

Выберите отдельные колонии с помощью гелезагрузочного наконечника для пипетки и перенесите каждую колонию непосредственно в одну лунку 96-луночного планшета U-образного дна, содержащего 20 микролитров 0,25% трипсина, ЭДТА, инкубируйте выбранные колонии и трипсин в течение примерно восьми минут при 37 градусах Цельсия или до тех пор, пока колонии не диссоциируют на отдельные клетки. Следите за ходом диссоциации с помощью световой микроскопии. Может потребоваться щадящее лечение.

Перенесите диссоциированную клеточную суспензию в 96-луночный планшет, содержащий питательный слой и 150 микролитров среды ЭСК с добавлением доксициклина и VPA. Когда колонии IPSC вновь появляются в каждой лунке, разделите их на более крупные лунки для анализа и хранения клеток с использованием стандартных процедур получения ЭСК и культивирования клеток, чтобы начать процедуру получения тетраплоидного бласт-ассиста. Одноклеточные эмбрионы, собранные у самок мышей, культивируются до двух клеточных эмбрионов в течение ночи в КСОМ при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа на следующий день. Поместите микрогорку BTX в 10-сантиметровую чашку Петри.

Налейте достаточно электроплавильной среды комнатной температуры, чтобы погрузить предметное стекло в раствор, но не настолько, чтобы полюса электрода были полностью погружены в воду. Включите электроэлементный манипулятор BTX ECM 2001 и усилитель BTX 400. Подсоедините кабели ЭБУ к электроду микрослайдов и закрепите кабели сбоку чашки Петри, чтобы предотвратить непреднамеренное перемещение предметного стекла.

Запустите один ручной импульс, чтобы получить показания на усилителе BTX и запомнить напряжение подаваемого постоянного тока. Переменный ток будет контролировать скорость, с которой эмбрионы выравниваются между электродами. Постоянный ток соединит богохульников, а время импульса установит длину импульса постоянного тока.

Хорошей отправной точкой является переменный ток три вольта, постоянный ток 100 вольт и умножить на 0,05 миллисекунды. Оптимальный постоянный ток варьируется в диапазоне от 90 до 150 вольт. С помощью пипетки для рта.

Возьмите от 30 до 42 клеточных эмбрионов из культуры КСОМ и перенесите их в каплю электроядерного синтеза. Среду промыть через несколько капель электросварной среды. Затем наберите свежую электроплавочную среду из микрослайдовой чашки в ротовую пипетку.

Возьмите отмытые эмбрионы и поместите их в один миллиметровый зазор между электродами на микропредметном стекле. Следите за тем, чтобы эмбрионы располагались посередине промежутка и не соприкасались друг с другом. Подайте переменный ток нажатием кнопки ручного запуска.

Эмбрионы будут вращаться в поле переменного тока до тех пор, пока плоскость контакта Блажье не станет параллельной электродам. Если эмбрионы не выравниваются в течение нескольких секунд, увеличьте настройку АС. После того, как эмбрионы выровнялись, нажмите кнопку ручного запуска еще раз, чтобы подать импульс постоянного тока с электротермоядерной средой в пипетке.

Соберите эмбрионы из микростекла, промывайте эмбрионы через несколько капель среды КСОМ, а затем культивируйте эмбрионы в КСОМ под минеральным маслом при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Плавление бластера должно быть завершено менее чем за 30 минут. В культуре успешно контролируют и отбирают эмбрионы с сросшимися бластомерами.

Сросшиеся эмбрионы, по-видимому, находятся на одной клеточной стадии, отбрасывают лизированные и две клеточные эмбрионы через 30 минут в культуре, продолжают культивировать сросшиеся эмбрионы в микрокаплях КСОМ под минеральным маслом при температуре 37 градусов Цельсия. 5%-ный углекислый газ для подготовки ИПК к взрывной инжекции, размораживают ранее накопленные ИПК и помещают их на кормушки в среде ESC, проходя к клеткам по крайней мере один раз на питателях. После размораживания перед использованием для инъекций.

Одна лунка из шести лунок, содержащая от 70 до 80% сливающихся ИПК обеспечит более чем достаточное количество клеток для инъекции аспирата питательной среды и промывания клеток тремя миллилитрами PBS без кальция или магния при 0,5 мл предварительного подогрева, 0,05% трипсина ЭДТА к клеткам, и инкубации при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут с периодическим покачиванием при 3,0 миллилитров среды ESC и повторения до получения одного клеточная суспензия. Наблюдайте за клетками с помощью световой микроскопии, чтобы убедиться, что суспензия одной клетки, колонии или клеточные агрегаты закупоривают пипетку для инъекций. После того, как будет получена суспензия за одну клетку, добавьте в лунку один миллилитр среды ESC и верните планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия.

Инкубируйте около 15 минут или до тех пор, пока большинство питающих клеток не начнут прилипать, аккуратно удалите среду, содержащую ИПК. Следите за тем, чтобы не вытеснить недельные прилипшие питающие клетки. Поместите ИПК в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров центрифуги ESC для среды при давлении 200 G, на пять минут.

Отсадите надосадочную жидкость и удалите остатки ЭСК с помощью микропипетки. Постучите по трубке, чтобы выбить гранулу, и осторожно восстановите ячейки в 0,2–0,5 миллилитрах предварительно охлажденной среды FHM. Храните клетки на льду до и во время инъекции в тетраплоид Бласт ассист Протокол для ввода бласт ассист см. в рукописи, сопровождающей эту статью, и в ранее опубликованной статье, отрывок из которой показан на экране здесь.

На этих изображениях показаны примеры морфологической прогрессии от фибробластов к колониям IPSC в ходе эксперимента по перепрограммированию. Морфологическую гетерогенность и частично перепрограммированное образование колоний IPSC следует наблюдать через четыре-пять дней после введения доксициклина VPA, как показано на панелях от B до EESC. Как и в случае с IPSC, колонии должны появиться в течение от 7 до 10 дней, как показано на панели F. Производство одноклеточных тело-эмбрионов путем электрослияния диплоидных двухклеточных эмбрионов является очень эффективным.

Обычно наблюдается до 95% обработанных двухклеточных эмбрионов, успешно слитых с образованием тетраплоидных одноклеточных эмбрионов. Протокол, используемый в этом эксперименте для введения IPSC в тетраплоидный бласт-ассист, аналогичен протоколу инъекции E SES в диплоидный бласт-ассист для создания химерных мышей, чтобы легко исключить генерацию диплоидных химер, пигментация мышиных линий, используемых для генерации IPS, и тетраплоидных эмбрионов тщательно выбирается, когда это возможно. В этом примере тетраплоидные эмбрионы производятся из штамма альбиноса, а IPSC — из пигментированного штамма.

Таким образом, новорожденные мыши IPSC демонстрируют пигментированные глаза и равномерно пигментированный цвет шерсти во взрослом возрасте, в то время как диплоидные киры демонстрируют смешанную альбиносную и пигментированную окраску. Количество рожденных живых детенышей зависит от клеточной линии, как показано в этой таблице. Для средней хорошей линии IPSC экспериментаторы должны ожидать, что от 1% до 10% введенного бласт-ассиста дадут живых новорожденных щенков.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить полностью плюрипотентные IPS-клетки, а также как проверить их потенциал развития. С помощью тетраплоидного анализа комплементации после освоения этой техники от получения MES до IPSC новорожденных, мыши могут быть завершены от двух до трех месяцев. Разработка и поддержание внутривенных ПСК требуют высокого уровня техники культивирования клеток.

Предыдущий опыт общения с культурой ESL имеет важное значение. Не забывайте работать с лентивирусом, особенно концентрированный лентивирус может быть чрезвычайно опасным. После этой процедуры следует всегда носить средства индивидуальной защиты, требуемые вашим учреждением, и обязательно обрабатывать все, что контактировало с вирусом, 10% отбеливателем в течение не менее 20 минут.

Все мыши IPSC и их ткани могут быть проанализированы на физиологические, патологические и поведенческие фенотипы.