Сопоставление бактериальных функциональных сетей и путей в Escherichia Coli Использование синтетических генетических массивы

Целью данной процедуры является исследование функциональных взаимоотношений между бактериальными генами и путями. Это достигается путем предварительной подготовки массивов ceia coli, одиночных мутантных штаммов, которые будут конъюгированы или спарены. Второй шаг заключается в конъюнкции одиночных мутантов в формате матрицы на пластинах.

Далее выбираются двойные мутанты. Последним шагом является визуализация двойных мутантных пластин и квантование двойных мутантных колоний для определения приспособленности штамма. В конечном счете, данные о размерах колонии анализируются для расчета показателей генетического взаимодействия и выявления функционально взаимодействующих генов, путей и процессов.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как случайный мутагенез, заключается в том, что может быть создано множество отдельных двойных мутантных штаммов. Более того, взаимодействия между многими генами могут быть оценены одновременно, независимо от размера гена, эссенциальности или приспособленности одного гена к мутанту. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области системной биологии, такие как вопросы, связанные с функциями генов и функциональными перекрестными взаимодействиями между путями и процессами.

Применение этого метода распространяется и на терапию бактериальных инфекций, поскольку знание о наиболее функционально центральных генах и процессах, а также понимание того, какие комбинации бактериальных генов, путей и процессов при нарушении улучшают или снижают бактериальную приспособленность, помогут разработать наиболее эффективные стратегии вмешательства. Двухступенчатый вложенный. ПЦР-амплификацию используют для замены открытой рамки считывания мишени маркером резистентности к хлорамфениколу из трех плазмид PKD, как описано в письменной методике.

Подтвердите предполагаемый продукт и ПЦР очистите полученный фрагмент в соответствии с протоколом производителя. После элюирования продукта ПЦР в 30 микролитрах стерильной дистиллированной воды разбавляют примерно до 50 миллиграмм на микролитр концентрации. Очищенный продукт хранится при температуре минус 20 градусов Цельсия до трансформации.

Затем подготовьте высокочастотные рекомбинацию или компетентные клетки HFR Caval для донорского конструирования. Сначала инокулируйте один миллилитр насыщенной ночной культуры штамма HFR Cavalli в 70 миллилитров свежей среды LB с концентрацией 35 микролитров 50 мг на миллилитр. Ампициллин в колбе объемом 250 миллилитров.

Инкубируйте культуру при температуре 32 градуса Цельсия, осторожно встряхивая со скоростью 220 об/мин до тех пор, пока не будет получена оптическая плотность примерно от 0,5 до 0,6. Затем перенесите культуру на водяную баню для индукции тепла рекомбинационной системы Lambda Red при температуре 42 градуса Цельсия на 15 минут с встряхиванием при 160 об/мин для остановки индукции. Перенесите культуру на водяную баню с охлажденной ледяной суспензией на 10-20 минут при 160 об/мин.

Убедитесь, что клетки остаются холодными до окончания трансформации. После промывки и сбора клеток методом центрифугирования, как описано в письменном протоколе, сцедите сенну и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах ледяного 10% глицерина Eloqua. Клетки в объемах 50 микролитров преобразуются в отдельные предварительно охлажденные 1,5 миллилитровые микроцентрические пробирки и сразу приступают к трансформации.

Добавьте 100 нанограммов очищенной делеции гена, кассету в компетентные клетки. Переверните трубку и дайте суспензии постоять на льду в течение пяти минут. Затем переведите суспензию в предварительно охлажденную электропорацию вете электро, немедленно обрабатывайте смесь ячеек.

Добавьте один миллилитр среды SOC комнатной температуры и перенесите электропорированные клетки в среду в 15-миллилитровую культуральную пробирку. Инкубируйте клетки при температуре 32 градуса Цельсия в течение одного часа с орбитальной тряской при 220 оборотах в минуту. После инкубации центрифугируйте клетки в 4,400 раз G в течение пяти минут.

При комнатной температуре удалите примерно 850 микролитров супината и снова суспендируйте клеточную гранулу в оставшейся жидкости. Распределите клетки на LB-планшетах, содержащих 17 микрограммов на миллилитр, хлорамфеникол и инкубируйте при температуре 32 градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день выделите два отдельных трансформатора на пластинах хлорамфеникола LB для подтверждения мутантов, выделите те же трансформанты на мициновых пластинах LB, чтобы подтвердить, что штаммы не устойчивы к мицину.

Затем ДНК амплифицируется тремя различными наборами праймеров для подтверждения нокаута, как описано в письменном протоколе. Первый набор праймеров состоит из 20 нуклеотидов, фланкирующего вперед праймера, расположенного на 200 парах оснований выше по потоку от целевой области, и обратного праймера, который является дополнением к кассете с резистентностью к хлорамфениколу. Ожидается, что эта амплификация приведет к образованию ампликона из 445 нуклеотидов.

Второй набор включает в себя прямой праймер, вставленный на колено к последовательности кассет с сопротивлением хлорамфениколу, и обратный фланкирующий подтверждающий праймер, который предназначен для выделения 200 пар оснований ниже трех основных концов удаленного гена. Ожидается, что в результате этой реакции амплификации образуется ампликон из 309 нуклеотидов. Третья ПЦР содержит как восходящие, так и нисходящие фланкирующие праймеры.

Эта реакция необходима для подтверждения того, что выбранный штамм не является диплоидом костного мозга, в котором один локус гена был заменен кассетой, а другой дублирован, но в остальном копия гена дикого типа все еще присутствует. Ожидается, что с помощью этого усиления получится продукт размером 1,4 КБ. Мутантная коллекция мутантов с делецией одного несущественного гена является роботизированной репликацией PIND до 24 384.

Ну и микропланшет, содержащий 80 микролитров жидкой среды LB на лунку. В сочетании с 50 мкг на миллилитр мицин может освободить место для пограничного контрольного штамма, который отсутствовал в качестве положительного контроля и помощи в нормализации планшетов, а также в автоматическом квантовании колоний. Удалите инокулированную среду из крайних лунок каждой пластины и переложите ее на новые пластины, оставив крайние лунки пустыми.

Аналогичным образом, создайте отрицательные контрольные точки, удалив любые два штамма из другого места в каждой пластине и перенеся деформации на новую пластину. Затем заполните пустые лунки, в том числе пограничные контрольные лунки и отрицательные контрольные лунки, средами ЛЖ, содержащими 17 микрограммов хлорамфеникола на миллилитр. Ожидается, что эти негативные контрольные точки будут пустыми у реципиента и, следовательно, двойными мутантными пластинами.

Они служат для того, чтобы гарантировать отсутствие ошибок обработки или обращения с пластинами при нумерации, изображении или закреплении пластин. После получения пограничного положительного штамма, как описано в письменной процедуре, матричные штаммы, а также пограничный положительный штамм выращивают в течение ночи при температуре 32 °Цельсия с орбитальным встряхиванием со скоростью 190 об/мин на следующий день, заполняют пограничные лунки примерно 80 микролитрами ночной культуры. Собранные пластины могут быть использованы для сопряжения, как описано в следующем разделе.

В качестве альтернативы, для длительного хранения, каждая лунка в пластинах-реципиентах добавляется 15% глицерина, а среда и глицерин смешиваются. Затем пластины хранятся при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Начните процедуру спаривания с выращивания донорского штамма HFR с делецией гена, помеченной в кассете с резистентностью к хлорамфениколу, в течение ночи при температуре 32 градуса Цельсия в богатой жидкой среде LB с концентрацией 17 микрограммов на миллилитр хлорамфеникола.

TH упорядочил коллекцию мутантов-реципиентов с плотностью колоний 3 84 на твердые пластины LB. Дополнено 50 микрограмм на миллилитр банки мицина. Параллельно закрепите донорский мутантный штамм с плотностью колонии 3 84 на такое же количество LB-планшетов.

Дополнен 17 микрограммами на миллилитр левомицетины. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 32 градуса Цельсия для конъюгации штаммов. Прикрепите донор из 3 84 колоний на ночлег на твердые пластины LB.

Затем прикрепите штаммы из одной пластины-реципиента из 3 84 колоний на только что прикрепленных доноров. Инкубируйте прикрепленные конъюгационные пластинки при температуре 32 градуса Цельсия в течение 16–24 часов. Затем прикрепите каждую конъюгационную пластину плотности 384 к одной твердой пластине LB, содержащей хлорамфеникол.

И может ли мицин повторять этот процесс до тех пор, пока все конъюгационные пластины не будут прикреплены? Инкубируйте только что прикрепленные первые отборочные пластины в течение 16–36 часов при температуре 32 градуса Цельсия. После инкубации прикрепите каждую первую селекционную пластину ко второй двойной селекционной пластине в формате 1536 SPOT так, чтобы каждая первая селекционная колония была представлена четырьмя колониями.

На второй отборочной пластине инкубируйте пластины от 16 до 36 часов. При 32 градусах OSS сфотографируйте последние двойные мутантные отборочные пластины, чтобы количественно измерить приспособленность мутантов к росту и проанализировать взаимодействие между парами генов. Поскольку гены в одном и том же пути демонстрируют тесно коррелированные паттерны ГИ, функционально родственные гены могут быть сгруппированы путем кластеризации их в соответствии с общим сходством их профилей S-оценки.

Сходство профиля ГИ представляет собой конгруэнтность фенотипов при мутации двух генов и должно указывать на то, действуют ли два гена в одном и том же или перекрывающемся пути. Здесь показано распределение коэффициентов корреляции между профилями ЖКТ пар генов, кодирующих физически взаимодействующие белки, и случайно выбранными парами генов. В качестве примера диаграммы рассеяния коррелированных генетических профилей для двух транспортеров, образующих гетеротримерный комплекс, необходимый для экскреции сперматозоидов, показан ген ecoline дрожжей.

Облегчающие взаимодействия с высококоррелированными профилями ЖКТ, как правило, кодируют пути, которые физически связаны или действуют согласованно в общем биохимическом пути. Здесь показан репрезентативный пример, в котором компоненты функционально избыточных путей биосинтеза железа и серы ISC и SUF, которые совместно участвуют в важном процессе, образуют отдельные кластеры, связанные друг с другом обширными отягощающими взаимодействиями. Статистическая мера может быть использована для поиска сколько-нибудь значительного обогащения взаимодействий между конкретными комбинациями путей, интеграции желудочно-кишечных сетей с физическими взаимодействиями и другими функциональными ассоциативными данными, такими как геномный контекст.

Взаимосвязи могут выявить организацию функциональных модулей более высокого порядка, которые определяют основные биологические системы бактерий. Кластерный анализ также может быть применен к желудочно-кишечным сетям для прогнозирования функций аннотированных генов. Так как алгоритмы кластеризации различаются.

Однако предполагаемые функциональные назначения, определенные с помощью кластеризации, требуют независимой экспериментальной проверки. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о включении всех необходимых положительных и отрицательных моментов после этой процедуры. Другие методы, такие как протеомика, биохимические последующие эксперименты и химическая геномика, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы о конкретных функциях генов, а также о природе функциональных отношений между генами и путями.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как конструировать двойные мутантные штаммы, собирать матрицы реципиентов и выполнять ESGA-скрининг для исследования функциональных отношений между генами и процессами в кишечной палочке.