Зеленый монстр процесса генерации штаммов дрожжей проведение нескольких удалений Гена

Общая цель данной процедуры заключается в создании штаммов дрожжей с множественными делециями, маркированными репортерным геном зеленого флуоресцентного белка. Это достигается путем предварительного получения гаплоидных одиночных мутантов, называемых «про-монстрами» (pro monsters), каждый из которых несет кассету делеции GFP вместо одного из целевых генов. Вторым этапом является сортировка делеций путем скрещивания и споруляции штаммов дрожжей с использованием двух наборов диплоидных и гаплоидных селективных маркеров, называемых GM toolkit A и GM toolkit alpha, которые также присутствуют в штаммах про-монстров.

Затем с помощью проточной цитометрии из популяции клеток в стадии мейоза отбираются клетки с высокой флуоресценцией для обогащения штаммами, несущими две делеции. Заключительным этапом является подтверждение генотипов отсортированных штаммов. В конечном итоге повторные циклы скрещивания и обогащения методом проточной цитометрии, начиная с полученных штаммов, позволяют создать штаммы с большим количеством делеций.

Основное преимущество данной методики перед существующими методами, такими как метод G для повторного использования маркеров и последовательного удаления генов, заключается в том, что за один цикл можно осуществить множественные делеции, что позволяет быстрее создавать мультимутантов. После получения про-монстров, как описано в письменном протоколе к данному видео, начинают сексуальный циклинг, подготавливая культуры созданных штаммов про-монстров с делецией GFP в микроцентрифужной пробирке объемом 1.6 мл. Подготовьте штамм с делецией типа спаривания A в 100 µL синтетической полной среды без гистидина (среда minus his). Также подготовьте штамм с делецией типа спаривания alpha в 100 µL синтетической полной среды без лейцина (среда minus lu) в микроцентрифужной пробирке объемом 1.6 мл для обеспечения газообмена.

Сделайте отверстия в крышках пробирок с помощью канцелярской кнопки, обработанной 70% ethanol. В течение ночи вращайте пробирки горизонтально при температуре 30 °C. Ось вращения должна быть параллельна продольной оси пробирки.

Оценив оптическую плотность, смешайте примерно 250 000 гаплоидных клеток и 250 000 гаплоидных клеток типа альфа штаммов с делецией GFP в пробирке Эппендорф объемом 1,6 мл. Такое количество клеток обычно соответствует 7 мкл каждой ночной культуры; перемешайте на вортексе. Подготовьте эти клетки, предварительно центрифугируя их при 800 ×g в течение двух минут.

После удаления супернатанта проделайте отверстие в крышке с помощью кнопки-гвоздя, обработанной 70% ethanol. Для обеспечения газообмена добавьте 50 µL среды YPDA, после чего быстро перемешайте на вортексе и центрифугируйте пробирку при 800 G в течение пяти минут. Затем поместите пробирку во влажную камеру, созданную из пустого бокса для наконечников, маленького штатива для наконечников и влажного бумажного полотенца.

Инкубируйте бокс в течение ночи при температуре 30 °C. Перенесите 10 µL смеси для скрещивания в 500 µL жидкой среды GNA без агара, содержащей антибиотики G 4 1 8 и nat, в пробирку объемом 5 мл с неплотно закрытой крышкой; начальная оптическая плотность при 600 нм составляет примерно 0,1. Культивируйте смесь при 30 °C в течение 24 часов на ротаторе.

Это позволяет проводить отбор диплоидов, поскольку только диплоиды, содержащие одновременно MX4 из GM toolkit A и natMX4, способны расти в присутствии G418 и Nat. Перенесите 20 µL односуточной культуры в 500 µL свежей среды GN, содержащей G418 и Nat. Начальная оптическая плотность при 600 нм составляет примерно 0,2.

Инкубируйте пробирку при температуре 30 °C в течение пяти часов, чтобы клетки вступили в логарифмическую фазу роста. Затем проведите корреляцию диплоидов и изолируйте споры. Следуйте процедуре, описанной в письменном протоколе.

Разделите суспензию клеток, связанных с SPO, на две части по 300 µL и перенесите каждую в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте пробирки при 800 G в течение пяти минут. После удаления супернатанта проделайте отверстие в крышке каждой пробирки.

С помощью дозатора добавьте 100 µL среды без гистидина к осадку в одной пробирке. Для селекции гаплотипа PT во второй пробирке добавьте 100 µL среды без лейцина для селекции альфа-гаплотипов.

Инкубируйте пробирки при 30 °C в течение ночи. Конечная оптическая плотность при 600 нм должна быть менее 0,5. Если оптическая плотность при 600 нм оказывается слишком высокой, инкубируйте при комнатной температуре.

Для индукции GFP добавьте 100 µL свежей среды minus hiss или minus LU, содержащей 20 µg/mL доксициклина, в разные штаммы. Конечная концентрация доксициклина составляет 10 µg/mL. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе и инкубируйте при 30 °C в течение двух дней в режиме ротации.

Для начала проведения проточной цитометрии добавьте 900 µL предварительно отфильтрованного ТЕ-буфера в полипропиленовую пробирку объемом 5 мл, заменив ее крышку на крышку-фильтр из полистирольной пробирки объемом 5 мл. Полипропиленовые пробирки подходят для проточной цитометрии. Крышка-фильтр необходима для удаления крупных частиц.

Осторожно нанесите 75 µL буфера на крышку сепаратора клеток. Добавьте 25 µL суспензии индуцированных клеток к раствору на крышке, прижимая кончик пипетки к сетке. Пропустите весь объединенный раствор через сепаратор.

Нажмите на крышку сита и перемешайте содержимое пробирки на вортексе. Подготовьте пробирки для сбора — пробирки Fendor объемом 1,6 мл, заполненные 200 µl среды minus hiss или minus lube. Запустите клеточный сортер и настройте параметры в соответствии с руководством производителя.

Перемешайте пробирки для сбора на вортексе, чтобы покрыть стенки среды. Также перемешайте на вортексе пробирку с клетками перед их загрузкой в клеточный сортер. Получите данные проточной цитометрии образца.

Штамм без GFP может служить отрицательным контролем. Установите гейты для сортировки таким образом, чтобы исключить агрегаты клеток, которые могут демонстрировать высокую интенсивность GFP. Удалите выбросы с непропорционально большой шириной импульса или площадью прямого светорассеяния (FSC), используя график зависимости ширины импульса от его высоты или график зависимости площади FSC от высоты FSC.

Поскольку для клеточных агрегатов ожидается высокий показатель FSC, отбирайте только клетки в нижних 20% по FSC. Избегайте областей с самыми низкими значениями FSC и бокового рассеяния (SSC), где часто обнаруживаются клеточные остатки. Сигналы SSC и GFP часто положительно коррелируют.

Чтобы избежать обогащения клеток с более высоким значением SSC, проведите гейт вдоль периферии популяции, используя график интенсивности GFP и SSC, чтобы отобрать одинаковый процент наиболее ярких клеток из каждой точки вдоль оси SSC. От 0,1 до 1% субпопуляции, выбранной с помощью гейтов FSC и SSC на предыдущем этапе, следует отметить для сортировки; отсортируйте 200 клеток в пробирку для сбора. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе, чтобы среда полностью покрыла отсортированные клетки, затем высейте их на планшет.

Часть клеток на чашке с средой A-Y-P-D-A для генотипирования. Инкубируйте чашку при 30 °C в течение двух дней после посева. Подготовьте лизат примерно из 12 колоний.

Следуйте шагам, изложенным в письменном протоколе генотипирования. Проанализируйте 1 µL разведенного лизата, используя ПЦР-реакцию объемом 10 µL с прямым праймером. Этот праймер отжигается на вышележащей фланкирующей области каждого делетированного гена в паре с общим праймером, который отжигается внутри всех локусов делеции.

ПЦР можно проводить в 96- или 384-луночном формате. После амплификации проанализируйте продукты ПЦР с помощью электрофореза.

Определите гаплоплазмы, которые, вероятно, имеют желаемые генотипы. Пересейте эти штаммы на свежую чашку. Также заморозьте их в 25% глицероле при температуре -80 °C.

Рекомендуется провести дополнительные тесты, такие как подтверждение отсутствия последовательностей дикого типа для делетированных генов, а также электрофорез в пульсирующем поле. Повторите сексуальные циклы с использованием подходящих штаммов. Гаплоидное потомство от скрещивания двух штаммов было индуцировано для экспрессии GFP.

Каждая делеция гена содержала кассету GFP. С помощью метода гейтирования на проточном цитометре была выделена популяция полученных клеток. В этой популяции вряд ли присутствуют клеточный детрит или агрегаты клеток. Самые яркие 1% клеток были отсортированы и отобраны путем гейтирования клеток по площади и высоте прямого светорассеяния.

Клеточные агрегаты, характеризующиеся непропорционально большой площадью прямого светорассеяния, были исключены. При гейтировании клеток на основе прямого и бокового светорассеяния принимались клетки в диапазоне нижних 20% по прямому светорассеянию, в то время как клеточный дебрис с наименьшими значениями прямого и бокового светорассеяния отсекался. При гейтировании на основе бокового светорассеяния и сигнала GFP выбирались более флуоресцентные клетки в пределах заданного диапазона бокового светорассеяния, что позволило сравнить миотическую смесь и образец отрицательного контроля, не экспрессирующий GFP. На диаграмме представлена схема AG, идентичная той, что использовалась для селекции популяции P3. Аналогично отобранные клетки отрицательного контроля в отдельном гаплоиде были проанализированы с помощью ПЦР после того, как они были индуцированы к экспрессии GFP и отсортированы по флуоресценции. Ожидаемое количество делеций для несортингованной клетки в результате случайной сегрегации составило 7,5.

В данном конкретном эксперименте отсортированные клетки имели среднее число делеций 8,8 ± 0,3, включая пять клеток, содержащих 10 делеций. Генотип DO. Сортировка штаммов PCL была выполнена с использованием обратного праймера.

Этот праймер отжигается на нижележащую фланкирующую область в паре с прямым праймером. Праймер That 10 отжигается на конце кассеты. Наличие полосы свидетельствует о присутствии кассеты GFP.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как использовать метод «зеленого монстра» (green Monster Method) для создания делеций у дрожжей.