Функциональная оценка моторики кишечника и воспаление стенки кишечника у грызунов: Анализы в стандартной модели Кишечные Манипуляции

Общая цель следующих экспериментов заключается в проведении кишечной манипуляции для изучения развития и разрешения послеоперационного илеуса на модели грызунов; это достигается путем стандартизированного воздействия на тонкий кишечник между двумя увлажненными хлопковыми аппликаторами. Затем анализируется транзит в желудочно-кишечном тракте и толстой кишке для оценки послеоперационной моторики. После этого проводится гистохимический анализ и культивирование органов мышечной оболочки тонкого кишечника (muscularis externa) для изучения уровней воспаления.

Полученные результаты демонстрируют выраженную инфильтрацию нейтрофильных гранулоцитов в слизистую оболочку и избыточную продукцию оксида азота в культурах слизистой оболочки, что приводит к увеличению времени транзита в желудочно-кишечном тракте и толстой кишке. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов, касающихся развития и устранения послеоперационного илеуса, а также при исследовании потенциальных методов профилактики или терапии. Процедуру продемонстрирует Марио Льюисон, техник нашей лаборатории. После введения 0,8–1% изофлурана в кислороде самцу мыши поместите животное в положение на спине и зафиксируйте конечности с помощью адгезивной ленты.

Используйте слабый болевой стимул для проверки глубины седации. Затем выполните срединную лапаротомию длиной два сантиметра. После этого введите два стерильных ретрактора для разведения краев раны, осторожно выведите петли тонкого кишечника влево и поместите их на влажную хлопковую марлю.

Используя два увлажненных ватных аппликатора, удалите содержимое просвета всего тонкого кишечника, одновременно прокатывая аппликаторы от порои до слепой кишки. Верните кишечник в брюшную полость, избегая перекручивания для предотвращения ишемии или механической обструкции, и используя два слоя непрерывного нерассасывающегося полиамидного шва 5.0. Зашейте разрез брюшной стенки.

Поместите животное под нагревательную лампу и наблюдайте за ним до полного восстановления после наркоза. Затем верните мышь в клетку, обеспечив ей доступ к корму и воде. На следующий день.

После полного наркотизирования мыши осторожно отведите голову назад и с помощью тупых пинцетов вытяните язык. Наберите в шприц объемом 1 мл не менее 100 µL декстрана, меченного флуоресцеином. Подсоедините шприц к артериальному катетеру и осторожно введите катетер в желудок в качестве желудочного зонда. Быстро введите 100 µL FITC-декстрана и извлеките катетер.

Дайте животному прийти в сознание и подождите 90 минут. По истечении 90 минут проведите эвтаназию мыши и извлеките весь желудочно-кишечный тракт от желудка до прямой кишки. Поместите кишечник на полистироловую подложку, избегая растягивания.

Затем измерьте полную длину тонкого кишечника и ободочной кишки. Используйте канюли, чтобы закрепить кишечник на полистирольном планшете. Разделите тонкий кишечник на 10 равных сегментов, а ободочную кишку — на три равных сегмента.

После поперечного разрезания кишечника в отмеченных позициях промойте секции один раз одним миллилитром буфера Кребса-Хеллингера-Бикара или KHB. Перенесите секции в последовательно промаркированные пробирки объемом два миллилитра, подвергните их интенсивному перемешиванию на вортексе и центрифугируйте. Затем перенесите супернадант в чистые пронумерованные пробирки объемом 1,5 миллилитра.

Храните при температуре 4 °C в темноте до проведения анализа. Затем с помощью пипетки перенесите по две аликвоты супернатанта объемом 100 µL каждого образца в черный 96-луночный планшет и измерьте флуоресценцию планшета на приборе для анализа флуоресценции, чтобы определить время колонического транзита после еженедельного наркоза животного.

Тщательно проверьте проходимость ободочной кишки, установив фистулу. С помощью зонда проведите зондирование из анального отверстия в ободочную кишку. Введите стеклянный шарик диаметром 2 мм на 3 см в ободочную кишку и извлеките зонд.

Немедленно запустите таймер. Поместите мышь в прозрачную клетку и наблюдайте за ней в течение времени, необходимого для экскреции шарика. Для гистохимического анализа образцов среднего отдела

После вырезания сегментов ткани кишечника и их погружения в холодный раствор KHB в чашке с силиконовым дном, с помощью энтомологических игл прикрепите брыжейку к дну чашки. Разрежьте сегменты вдоль края брыжейки и растяните ткань до 120% от ее первоначальной длины и ширины. Зафиксируйте ткань иглами, начиная с брыжейки. Механически.

Отделите наружную мышечную оболочку (muscularis externa) от слизистой оболочки (tunica mucosa). Зафиксируйте и окрасьте образцы в соответствии с текстовой частью данного протокола по культивированию. Наружная мышечная оболочка.

Через 24 часа после процедуры манипуляции на кишечнике резектируйте весь тонкий кишечник и поместите его в холодный раствор KHB, содержащий пенициллин G и стрептомицин. Разрежьте кишечник на сегменты длиной по 3 см и закрепите каждый сегмент на стеклянном предметном стекле с силиконовым покрытием с помощью тонких ножниц. Удалите брыжейку и с помощью острого пинцета наденьте кишечник на иглу для фиксации.

Осторожно введите зонд, используя увлажненный ватный тампон. Отделите его от подслизистого слоя и поместите в холодный KHB с добавлением Ps. Затем разрежьте полоски ME на фрагменты длиной от двух до четырех миллиметров и инкубируйте их в ледяном KHB с добавлением PS в течение 30 минут. Промойте образец несколько раз.

Затем перенесите примерно 50–60 mg ткани в стерильный 24-луночный планшет, содержащий 500 µL DMEM. Инкубируйте ткань при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов. Соберите супернатант и центрифугируйте при 1000 RCF в течение пяти минут.

Затем быстро заморозьте образец в жидком азоте для последующего измерения уровней цитокинов или оксида азота. В завершение промокните мышечную ткань чистой бумажной салфеткой в течение 30 секунд, после чего взвесьте её. Наиболее важным параметром для оценки степени тяжести послеоперационного илеуса является исследование желудочно-кишечного транзита (ЖКТ) in vivo.

На этом рисунке показано типичное распределение FITC-декстрана по желудочно-кишечному тракту у контрольных животных без лечения и у мышей с манипуляциями на кишечнике через 24 часа после операции. Как видно здесь, у животных группы ложной операции ЖКТ функционировал нормально, а расчетный геометрический центр находился в слепой кишке. В то время как Im привел к значительному замедлению транзита по ЖКТ в проксимальном отделе тощая кишки, при анализе моторики толстой кишки с использованием стеклянного шарика мыши группы ложной операции вывели шарик в течение 48–200 секунд, а Im увеличил время выведения до 470–775 секунд для оценки воспаления.

Уровни лейкоцитов в слизистой оболочке кишечника анализировали с помощью гистохимии или иммуногистохимии, как показано здесь. У контрольных мышей наблюдалось лишь несколько полиморфноядерных нейтрофилов, однако воспаление тонкого кишечника привело к их массивной инфильтрации. Многие воспалительные медиаторы, высвобождаемые клетками, трудно обнаружить в ткани.

Лизаты органных культур позволяют выявлять воспалительные маркеры в культуре. Супернатант, репрезентативным медиатором при POI является оксид азота, или NO, который представляет собой основной тормозный нейромедиатор в желудочно-кишечном тракте. На данном рисунке показано, что NO не удалось обнаружить в me.

При культивировании органов, анализе супернатантов контрольной группы и животных с ложнооперированными мышами наблюдались базовые уровни nno. Однако культуры из кишечников манипулированных мышей вырабатывают значительно больше nno после 24-часовой инкубации. При должном освоении эта техника манипуляции с кишечником может быть выполнена в течение 15 минут.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как индуцировать послеоперационный илеус у мышей и как анализировать степень его тяжести.