Multi-параметр измерения проницаемости пор Переход Открытие в изолированном сердце мыши Митохондрии

Цель этого видео — описать процедуру характеристики перехода митохондриальной проницаемости. Плохое отверстие в митохондриях, изолированных от мышиного сердца. Во-первых, митохондрии выделяются из сердца мышей.

Используя метод дифференциального центрифугирования, качество изолированных митохондрий затем оценивается с помощью кислородно-термического кислородного электрода, подключенного к компьютеру, для измерения соотношения респираторного контроля и оценки целостности митохондриальной мембраны. Затем с помощью спектрофлюориметрических приборов одновременно измеряют обработку кальция, потенциал митохондриальной мембраны и митохондриальный объем для определения перехода проницаемости. Плохое открытие.

Полученные данные показали различия в способности удерживать кальций и переходе митохондриальной проницаемости. Плохая чувствительность изолированных митохондрий, открытие митохондриального перехода проницаемости. Поры – это сложное явление, которое включает в себя изменения на нескольких уровнях в физиологии и анатомии митохондрий.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что одновременное измерение нескольких параметров дает более полную картину явления, чем измерение только отдельных параметров, таких как кальций, мобилизация или отек. Перед началом процедуры разморозьте изолирующий буфер митохондрий и проверьте pH, который должен составлять 7,4. Затем поместите все буферы, тарелки и трубки, которые будут использоваться, на лед. Обратите внимание, что все этапы протокола изоляции митохондрий должны выполняться на льду.

Поместите сердца усыпленных мышей на чашку Петри и смойте кровь холодными митохондриями. Изоляционный буфер. Далее переложите сердечки в новую чашку Петри с помощью лезвия, удалите жир и предсердия, затем пропустите через мясорубку сердечки до получения однородного продукта.

Переложите измельченные сердечки в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Добавьте 10 миллилитров изолирующего буфера митохондрий с концентрацией трипсина 0,1 миллиграмма на миллилитр и дайте образцу перевариться на льду в течение 10 минут. Обратите внимание, что применение трипсина увеличивает выход изолированных митохондрий и должно поддерживаться постоянным между митохондриальными препаратами.

Тем не менее, мы рекомендуем проверить функциональность изолированных митохондрий на препаратах, полученных в отсутствие трипсина, чтобы убедиться, что фермент не влияет на их ионы. После инкубации добавьте 10 миллилитров изолирующего буфера митохондрий, содержащего 0,1% без жирных кислот, BS, A и пять мг ингибитора трипсина, и перемешайте, перевернув трубку несколько раз. Чтобы нейтрализовать трипсин, восстановите переваренную ткань с низкой и средней скоростью. Центрифугирование в течение одной минуты при температуре четыре градуса Цельсия.

После спин-реанимации суспензируйте ткань в восьми миллилитрах буфера для выделения митохондрий с 0,1% БСА, не содержащим жирных кислот, удерживая образец на льду. Используйте моторизованный танцевальный гомогенизатор с тефлоновым пестиком для гомогенизации образца за четыре-шесть проходов при 1 200 до 1 400 об/мин. Переложите гомогенат в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 800-кратном G в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Для гранулирования ядер и остатков тканей. После вращения соберите супинат, содержащий митохондрии, в микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте их при температуре 8000 G в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После вращения на дробинке сверху будет нанесен белый слой.

Используйте вакуумную систему для тщательной аспирации и удаления белого слоя поверх митохондриальной гранулы. Затем повторно суспендируйте оставшуюся более темную гранулу, которая содержит митохондрии в одном миллилитре митохондрий. Изоляционный буфер.

Затем центрифугируйте митохондрии при температуре 8000 раз G в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Выбросьте супинат и ресуспендируйте митохондриальную гранулу. В 150 микролитрах митохондрий выделяют буфер, удерживают митохондрии на льду.

Дыхание изолированных митохондрий измеряется с помощью кислородно-кислородного электрода, подключенного к компьютеру и управляемого кислородом. Плюс программного обеспечения, кислородный электрод должен быть откалиброван в день проведения эксперимента. Добавьте два миллилитра митохондриального дыхательного буфера, содержащего конечную концентрацию одного микромолярного ротенона, в кислородную камеру, запечатайте камеру и начните записывать кислородный сигнал.

Сигнал, регистрируемый системой и отображаемый на экране компьютера, пропорционален концентрации кислорода в кислородной термической камере. Как только сигнал кислорода стабилизируется, добавьте 250 микрограммов митохондрий и запишите базальное дыхание в течение одной минуты. Дыхание в этот момент должно быть очень низким, так как митохондрии стремятся к эндогенным субстратам.

Это дыхание первого состояния. Добавьте сукцинат до конечной концентрации в пять миллимоляров, чтобы начать митохондриальное дыхание в комплексе два, и запишите сигнал в течение одной минуты. Потребление кислорода должно увеличиваться во время дыхания второго состояния.

Чтобы вызвать состояние дыхания, добавьте DP в конечную концентрацию 150 микромоляров. На этом этапе потребление кислорода должно увеличиться из-за синтеза ТП путем окислительного фосфорилирования. Записывайте сигнал до тех пор, пока дыхание не замедлится, указывая на потребление DP и переход к четвертому состоянию дыхания.

Состояние четвертое, дыхание не менее одной минуты. Добавьте CCCP к конечной концентрации в один микромоляр и запишите сигнал в течение одной минуты. На этом этапе несвязанное дыхание должно быть максимальным.

Рассчитайте коэффициент контроля дыхания, разделив норму потребления кислорода в третьем состоянии. Дыхание по скорости потребления кислорода в состоянии четыре, дыхание по целевому RCR должно быть больше четырех. Затем, чтобы оценить целостность митохондриальной мембраны, вызвать дыхание третьего состояния в новом образце митохондрий, добавив DP к конечной концентрации в один миллимоляр.

Затем зарегистрируйте потребление кислорода в течение одной минуты, добавьте 10 микромолярных цитохромов С и запишите потребление кислорода в течение двух-трех минут. Поскольку цитохром С непроницаем для неповрежденных митохондриальных мембран в хорошем митохондриальном препарате, не будет увеличения дыхания или будет очень небольшое увеличение. Учащение дыхания свидетельствует о разрыве или повреждении митохондриальных мембран.

Приборы для многопараметрического измерения открытия переходного порта митохондриальной проницаемости состоят из квантового мастер-флуориметра с двойным эмиссионным спектрометром, управляемого программой Felix GX. С помощью программы Felix GX создать протокол мультиди сбора данных и ввести параметры для измерения потенциала митохондриальной мембраны кальция и набухания для соотношения метрических красителей, Форер и JC один генерируют выведенные следы для отношения и JC одного соотношения в одноразовом четырехстороннем метамфетамине ACRL vete mix один миллилитр митохондриального буфера для анализа с конечной концентрацией одного микромоляра ротенона, пять миллимоляров сукцината и 800 наномоляров. Для СЖ добавьте 250 микрограммов митохондрий и поместите образец в отсек для образцов спектрофлуориметра.

Начните запись флуоресцентных сигналов через одну минуту, приостановите регистрацию, добавьте 500 наномолярных JC One и затем возобновите регистрацию. Сигнал JC one ratio должен увеличиваться, указывая на поглощение кристалла активными митохондриями. Продолжайте запись до тех пор, пока сигнал JC One не достигнет плато.

Обычно в течение пяти минут добавляют хлорид кальция до конечной концентрации 20 микромоляров. Следует наблюдать мгновенное увеличение сигнала соотношения Fluor FF, представляющее собой повышенное присутствие кальция в буфере для анализа, с последующим постепенным снижением из-за поглощения кальция митохондриями. Сигнал JC one ratio должен демонстрировать кратковременное переходное снижение, указывающее на незначительную деполяризацию митохондриальной мембраны.

Когда сигнал отношения ER FF возвращается к базальному уровню, обычно в течение одной-1,5 минут на еще 20 микромолярах хлорида кальция, продолжайте пульсировать через фиксированные промежутки времени до тех пор, пока митохондрии не смогут накапливать кальций и не начнут высвобождать кальций в буфер для анализа. Открытие переходного порта митохондриальной проницаемости визуализируется одновременным увеличением сигнала отношения URA FF из-за высвобождения кальция. Уменьшение отношения сигналов JC one из-за коллапса мембранного потенциала и уменьшение рассеяния света из-за митохондриального набухания митохондрий при выделении из C 56 черных шести J мышей.

Как показано на этом видео, потребление кислорода затем измерялось во время дыхания в третьем состоянии в присутствии сукцината и DP и во время дыхания в четвертом состоянии после потребления DP, как показано здесь, добавление DP увеличивает потребление кислорода из-за окислительного фосфорилирования, и потребление кислорода замедляется. После того, как все ДП были употреблены, реакция изолированных митохондрий на разъединение измеряется добавлением CCCP в присутствии CCCP. Скорость потребления кислорода выше, чем при третьем состоянии дыхания для оценки целостности мембраны изолированных митохондрий.

Потребление кислорода измеряли в присутствии сукцината и ДП, и после добавления цитохрома C.As, как показано здесь, добавление цитохрома С не приводит к значительному увеличению потребления кислорода по отношению к ДП и сукцинату, что указывает на то, что интактные митохондриальные мембраны не проницаемы для цитохрома С для оценки перехода митохондриальной проницаемости, плохого открытия в изолированных митохондриях сердца как показателя способности митохондрий удерживать кальций. Переход митохондриальной проницаемости. Плохое открытие было вызвано последовательным добавлением 20 микромоляров.

Хлорид кальция, экстра митохондриальный кальций и мембранный потенциал измеряли с помощью метрических показателей. URA FF, показанный как зеленый след, и JC, показанный как красный след: набухание митохондрий было измерено путем регистрации рассеяния света на 525 нанометрах, показанного черным следом. Специфичность JC one и набухающие сигналы проверяли с помощью одного микромоляра, CCCP и пяти микрограммов на миллилитр микробного токсина этина. Как видно здесь, поглощение кальция митохондриями сопровождается небольшой деполяризацией митохондриальной мембраны.

После четырех кальциевых импульсов открытие бассейна переходной проницаемости митохондрий наблюдается как увеличение URA FF, указывающее на высвобождение кальция. Уменьшение JC one указывает на коллапс мембранного потенциала и увеличение объема митохондриального матрикса, что рассматривается как уменьшение рассеяния света как маркер набухания для проверки специфичности открытия переходного порта митохондриальной проницаемости. Те же измерения были проведены в присутствии циклоспорина А, который связывается с митохондриальным переходным компонентом ПО циклофиллина D.As показано на этом рисунке, наличие одного микромолярного циклического отверстия А увеличивает количество импульсов хлорида кальция, необходимых для открытия митохондриального перехода проницаемости ПО по сравнению с контрольным образцом.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценить открытие порта перехода митохондриальной проницаемости в изолированных митохондриях сердца. Самым сложным аспектом этой процедуры является получение изолированных митохондрий хорошего качества. Поэтому важно проводить измерения контроля качества перед использованием митохондрий для дальнейших экспериментов.