Multi-параметр измерения проницаемости пор Переход Открытие в изолированном сердце мыши Митохондрии

Целью данного видео является описание процедуры характеристики пор mitochondrial permeability transition (митохондриального проницаемого перехода). Недостаточное открытие пор в митохондриях, выделенных из сердца мыши. Сначала митохондрии выделяют из сердец мышей.

С помощью метода дифференциального центрифугирования изолируют митохондрии, качество которых затем оценивают с использованием кислородного электрода, подключенного к компьютеру, для измерения коэффициента респираторного контроля и оценки целостности митохондриальной мембраны. Затем с помощью спектрофлуориметрического оборудования проводят одновременное измерение обмена кальция, митохондриального мембранного потенциала и объема митохондрий для определения открытия поры при переходе к проницаемости.

Полученные данные выявили различия в способности к удержанию кальция и митохондриальном переходе проницаемости. Низкая чувствительность изолированных митохондрий, открытие поры митохондриального перехода проницаемости представляет собой сложный феномен, включающий изменения на нескольких уровнях физиологии и анатомии митохондрий.

Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами является то, что одновременное измерение нескольких параметров дает более полную картину явления, чем измерение отдельных параметров, таких как уровень кальция, мобилизация или набухание. Перед началом процедуры разморозьте буфер для выделения митохондрий и проверьте pH, который должен составлять 7,4. Затем поместите все используемые буферы, чашки и пробирки на лед. Обратите внимание, что все этапы протокола выделения митохондрий должны проводиться на льду.

Поместите сердца эвтаназированных мышей в чашку Петри и промойте от остатков крови холодным буфером для изоляции митохондрий. Затем с помощью лезвия перенесите сердца в новую чашку Петри, удалите жировую ткань и предсердия, после чего измельчите сердца до получения однородной массы.

Перенесите измельченные сердца в коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте 10 мл буфера для выделения митохондрий с содержанием трипсина 0,1 мг/мл и оставьте образец для переваривания на льду на 10 минут. Обратите внимание, что использование трипсина повышает выход выделенных митохондрий, и его количество должно оставаться неизменным при подготовке всех образцов митохондрий.

Тем не менее, мы рекомендуем проверить функциональную активность изолированных митохондрий на препаратах, полученных без использования трипсина, чтобы убедиться, что фермент не влияет на их ионы. После инкубации добавьте 10 миллилитров буфера для изоляции митохондрий, содержащего 0,1% безжировой сыворотки бычьей крови (BS, a) и пять миллиграммов ингибитора трипсина, и перемешайте, несколько раз перевернув пробирку. Чтобы нейтрализовать трипсин, осадите переваренную ткань путем центрифугирования на низкой или средней скорости в течение одной минуты при температуре четырех градусов Цельсия.

После центрифугирования ресуспендируйте ткань в 8 мл буфера для выделения митохондрий с 0,1% BSA без жирных кислот, поддерживая образец на льду. Используйте моторизированный гомогенизатор с тефлоновым пестиком для гомогенизации образца, выполнив от четырех до шести проходов при 1 200–1 400 об/мин. Перенесите гомогенат в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 800 ×g в течение 10 минут при 4 °C.

Для осаждения ядер и тканевого детрита. После центрифугирования сберите супернатант, содержащий митохондрии, в микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте их при 8 000 ×g в течение 15 минут при температуре 4 °C. После центрифугирования над осадком образуется белый слой.

Используйте вакуумную систему, чтобы осторожно аспирировать и удалить белый слой над осадком митохондрий. Затем повторно ресуспендируйте оставшийся более темный осадок, содержащий митохондрии, в 1 mL буфера для выделения митохондрий.

Затем центрифугируйте митохондрии при 8, 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок митохондрий в 150 µL буфера для выделения митохондрий; храните митохондрии на льду.

Дыхание изолированных митохондрий измеряют с помощью окситермального кислородного электрода, подключенного к компьютеру и управляемого с помощью программного обеспечения oxy. The plus. Кислородный электрод должен быть откалиброван в день проведения эксперимента. В камеру оксиметра добавьте 2 мл буфера для дыхания митохондрий, содержащего ротенон в конечной концентрации 1 µM, закройте камеру и начните регистрацию сигнала содержания кислорода.

Сигнал, регистрируемый системой и отображаемый на экране компьютера, пропорционален концентрации кислорода в окситермической камере. После стабилизации сигнала кислорода добавьте 250 micrograms митохондрий и регистрируйте базальное дыхание в течение одной минуты. Дыхание на данном этапе должно быть очень низким, так как митохондрии дышат на эндогенных субстратах.

Это дыхание в состоянии 1. Добавьте сукцинат до конечной концентрации 5 мМ для инициации митохондриального дыхания через комплекс II и регистрируйте сигнал в течение одной минуты. При дыхании в состоянии 2 потребление кислорода должно увеличиться.

Для инициации дыхания в состоянии 3 добавьте DP до конечной концентрации 150 micromolar. В этот момент потребление кислорода должно увеличиться за счет синтеза TP посредством окислительного фосфорилирования. Регистрируйте сигнал до тех пор, пока скорость дыхания не снизится, что будет свидетельствовать о расходовании DP и переходе к записи дыхания в состоянии 4.

Стадия четыре: дыхание в течение как минимум одной минуты. Добавьте CCCP до конечной концентрации 1 µM и регистрируйте сигнал в течение одной минуты. На данном этапе разобщенное дыхание должно быть максимальным.

Рассчитайте коэффициент респираторного контроля, разделив скорость потребления кислорода во время дыхания в состоянии 3 на скорость потребления кислорода во время дыхания в состоянии 4; целевое значение RCR должно быть больше четырех. Затем, для оценки целостности митохондриальной мембраны, индуцируйте дыхание в состоянии 3 в новом образце митохондрий, добавив DNP до конечной концентрации 1 мМ.

Затем регистрируйте потребление кислорода в течение одной минуты, добавьте 10 µM цитохрома C и регистрируйте потребление кислорода в течение двух-трех минут. Поскольку в качественном препарате митохондрий цитохром C не проникает через интактные митохондриальные мембраны, увеличение дыхания будет отсутствовать или будет незначительным. Усиление дыхания указывает на разрыв или повреждение митохондриальных мембран.

Оборудование для многопараметрического измерения открытия поры митохондриального прохода проницаемости состоит из квантового двухлучевого эмиссионного спектрофлуориметра Quantum Master, управляемого компьютером с помощью программы Felix GX. С помощью программы Felix GX создайте протокол многоканального сбора данных и введите параметры для измерения потенциала митохондриальных мембран при воздействии кальция и набухания для рациометрических красителей Forer и JC-1; сформируйте производные кривые для отношения Forer и отношения JC-1 в одноразовой четырехсторонней кювете из ПММА. Смешайте 1 mL буфера для анализа митохондрий с конечной концентрацией 1 µM ротенона, 5 mM сукцината и 800 nM. Для одной пробы добавьте 250 µg митохондрий и поместите образец в кюветное отделение спектрофлуориметра.

Начните запись флуоресцентных сигналов через одну минуту, приостановите сбор данных, добавьте 500 нМ JC-1, а затем возобновите сбор данных. Сигнал соотношения JC-1 должен увеличиться, что указывает на поглощение красителя активными митохондриями. Продолжайте запись до тех пор, пока сигнал JC-1 не достигнет плато.

Обычно в течение пяти минут добавьте хлорид кальция до конечной концентрации 20 µM. Должен наблюдаться мгновенный рост сигнала отношения Fluor FF, что свидетельствует о повышении содержания кальция в буфере для анализа, с последующим постепенным снижением из-за поглощения кальция митохондриями. Сигнал отношения JC-1 должен показать кратковременное транзиторное снижение, указывающее на незначительную деполяризацию митохондриальной мембраны.

Когда сигнал отношения ER FF возвращается к базальному уровню, обычно в течение 1–1,5 минут, добавьте еще 20 micromolar хлорида кальция. Продолжайте вводить импульсы через фиксированные интервалы времени до тех пор, пока митохондрии не перестанут накапливать кальций и не начнут высвобождать его в буфер для анализа. Открытие поры митохондриального прохода проницаемости визуализируется по одновременному увеличению сигнала отношения URA FF вследствие высвобождения кальция. Также наблюдается снижение отношения сигнала JC one из-за коллапса мембранного потенциала и уменьшение светорассеяния из-за набухания митохондрий, выделенных из мышей C 56 black six J.

Как показано в этом видео, затем измеряли потребление кислорода во время дыхания в состоянии три в присутствии сукцината и ADP, а также во время дыхания в состоянии четыре после потребления ADP; как здесь видно, добавление ADP увеличивает потребление кислорода за счет окислительного фосфорилирования, после чего скорость потребления кислорода снижается. После полного потребления ADP оценивают реакцию изолированных митохондрий на разобщение путем добавления CCCP; в присутствии CCCP скорость потребления кислорода становится выше, чем при дыхании в состоянии три, что позволяет оценить целостность мембран изолированных митохондрий.

Потребление кислорода измеряли в присутствии сукцината и DP, а также после добавления цитохрома C. Как видно здесь, добавление цитохрома C не вызывает значительного увеличения потребления кислорода по сравнению с DP и сукцинатом, что указывает на то, что интактные митохондриальные мембраны непроницаемы для цитохрома C. Для оценки митохондриального порога открытия пор, характеризующего емкость удержания кальция в изолированных митохондриях сердца, использовали показатель митохондриального перехода проницаемости. Открытие пор вызывали последовательным добавлением 20 micromolar.

Концентрацию хлорида кальция, содержание внемитохондриального кальция и мембранный потенциал измеряли с помощью рациометрических индикаторов. URA FF представлен зеленой линией, а JC-1 — красной линией; набухание митохондрий оценивали путем регистрации светорассеяния на длине волны 525 нм, что показано черной линией. Специфичность сигналов JC-1 и набухания проверяли с использованием 1 µM CCCP и 5 µg/mL микробного токсина этиона; как видно здесь, захват кальция митохондриями сопровождается легкой деполяризацией митохондриальной мембраны.

После четырех импульсов кальция открытие поры митохондриального прохода проницаемости проявляется в виде увеличения URA FF, что указывает на высвобождение кальция. Снижение JC one свидетельствует о коллапсе мембранного потенциала, а увеличение объема матрикса митохондрий, которое проявляется как снижение светорассеяния (маркер набухания), подтверждает специфичность открытия поры митохондриального прохода проницаемости. Те же измерения проводились в присутствии циклоспорина А, который связывается с компонентом поры митохондриального прохода проницаемости — циклофилином D. Как показано на данном рисунке, присутствие 1 µM циклоспорина А увеличивает количество импульсов хлорида кальция, необходимых для открытия поры митохондриального прохода проницаемости, по сравнению с контрольным образцом.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как оценивать открытие митохондриальной поры переходной проницаемости в изолированных митохондриях сердца. Самым сложным аспектом данной процедуры является получение качественных изолированных митохондрий. Поэтому важно проводить контрольные измерения качества перед использованием митохондрий в дальнейших экспериментах.