Гетеротипические Трехмерные In Vitro Моделирование Стромальные-эпителиальных взаимодействий во время посвящения яичников Рак и прогресс

Общая цель данного эксперимента заключается в создании трехмерных типических моделей развития рака яичников на ранних стадиях. Во-первых, создайте иммортализированные клеточные линии H. turt, полученные из первичных, нормальных эпителиальных тканей яичников и фибробластов. Затем, чтобы воссоздать in vivo архитектуру и сложные клеточные взаимодействия, присутствующие в совместной культуре яичников, эпителиальные и стромальные клеточные линии в трехмерных моделях S-сфероидов, приступают к фиксации и окрашиванию органоидных культур и анализируют экспрессию специфических маркеров с целью изучения молекулярных особенностей стромальных эпителиальных взаимодействий.

Полученные результаты показывают, как изменения в компартменте стромальных клеток 3D-типических моделей могут влиять на фенотип сокультивируемых эпителиальных клеток. Трехмерные типичные модели могут помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований рака яичников, такие как изучение истоков этого заболевания и выяснение роли микроокружения стромы в инициации и развитии опухоли. Применение этих методов распространяется на диагностику и терапию заболеваний по сравнению с другими методами 3D-культивирования.

Этот метод может быть применен к более широкому диапазону объемов клеточных культур и последующим применениям. Например, 3D homo и типические культуры могут быть использованы для тестирования лекарств in vitro. Этот подход также может быть применен к другим модельным системам, например, при изучении других типов солидных опухолей или при доброкачественных заболеваниях.

Транспортируйте свежую ткань яичников в лабораторию для культивирования клеток в иммортализованной нормальной среде для роста фибробластов яичников с дополнительными антибиотиками и антикватными препаратами. Промойте образец три раза пятью миллилитрами PBS, чтобы удалить все эпителиальные клетки, которые остаются слабо прикрепленными к ткани. Затем перенесите образец и PBS в чистую чашку для культуры P 100 Используя стерильные инструменты, перенесите ткань во вторую сухую чашку для чистой культуры P 100.

Разрежьте ткань на кусочки по 0,5 квадратного сантиметра и переложите каждый кусочек в отдельную посуду Р 100. Продолжайте разрезать ткань на кусочки размером менее одного квадратного миллиметра. Затем добавьте 20 миллилитров среды INOF GM и мониторьте культуру для роста клеток с помощью фазовой микроскопии.

Подтвердите, что клетки прилипают к чашке в течение 24 часов. Отслеживайте рост клеток с помощью фазовой микроскопии Клетки обычно прилипают к чашке в течение 24 часов Через неделю. Удалите любую неадгезивную ткань с помощью аспирации, пополните среду и после этого повторно подкармливайте культуры два раза в неделю в течение одной-трех недель, когда клеточные колонии достигают размера около 500 микрон.

Изолируйте клоны с помощью трипов и дисков для клонирования с покрытием. Для того, чтобы подтвердить 100% фибробластические клетки. Нанесите образец клеточной линии на стеклопакеты и выполните иммунофлуоресцентное окрашивание для фибробластического маркера, эпителиального маркера и маркера эндотелиальных клеток.

За день до ретровирусной трансдукции прохода H. Turt нормальные клетки фибробластов яичников изолируются из одной чашки P 100 в три чашки P 100. Готовый вирусный супнатан может быть приобретен или произведен на месте с использованием стандартных протоколов для трансфекции HEC 2 9 3 Т-клеток. Чтобы приготовить раствор полихема, взвесьте 1,5 грамма полихемы и поместите в стерильную бутылку.

Добавьте 95 миллилитров абсолютного этанола и пять миллилитров дистиллированной воды для клеточных культур. Поместите раствор полихемы на водяную баню при температуре 65 градусов Цельсия до полного растворения. Смажьте чашки для культуры тканей свежеприготовленным раствором Poly Hema.

Сушите на воздухе чашки для клеточных культур внутри ламинарного проточного колпака. Мягкое покачивание на качающейся платформе может быть использовано для обеспечения равномерного покрытия посуды или колб большего размера. Если раствор полюса будет высыхать слишком быстро, поверхность не будет гладкой.

При желании перед 3D-культивированием предварительно обрабатывайте фибробласты, например, для индукции старения предварительно обрабатывайте клетки сублетальными дозами перекиси водорода. Восстановление и расширение культур INOF и эпителиальных клеток in vitro для подготовки достаточного количества клеток для введения 3D-гетеротопических стероидов. После пятиминутной промывки PBS добавьте 15 миллилитров среды в полигема-пластину.

Между тем, добавьте трипсин к иммортализированным нормальным клеткам фибробластов яичников, чтобы отделить их от чашки для культивирования. Через три-пять минут нейтрализуйте трипсин равным объемом питательной среды и соберите клетки центрифугированием. Ресуспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах средней массы и хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз или осторожно поворачивая.

Затем с помощью образца объемом 10 микролитров перечислите жизнеспособные клетки с помощью трианового синего. Теперь добавьте 4 миллиона элементов INOF к среде, уже распределенной в пластину с полимерным покрытием. Восполните питательную среду объемом до 20 миллилитров и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа.

Контролируйте клеточную агрегацию в многоклеточные стероиды с помощью фазовой микроскопии для повторного введения культур S-сфероидов каждые два-три дня. Положите пластины под углом на пипетку. Дайте сфероидам осесть и осторожно удалите около 16 миллилитров отработанной среды пятимиллилитровой пипеткой.

Добавьте к культуре 16 миллилитров свежей среды и верните в инкубатор на седьмой день. Создание гетеротипических культур путем добавления эпителиальных клеток к фибробластам phe. Во-первых, приготовьте суспензии эпителиальных клеток яичников с помощью трипсина, как описано ранее, после перечисления клеток.

Промойте один раз в среде INOF GM, чтобы предотвратить перенос факторов роста из эпителиальных питательных сред. После восполнения среды OID культур фибробластов добавляют эпителиальные клетки в соотношении четыре к одному фибробластам к культуре эпителиальных клеток. Гетеротопные ОИДЫ в INOF GM повторно скармливают типичные культуры каждые два-три дня в течение дополнительных 14 дней.

Для иммуногистохимии закрепите PHE нейтральным буферным формином, гранулируйте PHE и замените формалин на 70% этанол. Приступайте к переработке в парафин по стандартным протоколам, используемым для тканей человека. Стероиды, залитые парафином, могут быть разделены и окрашены h и e специфических молекулярных маркеров с использованием иммунобиологической химии.

В качестве альтернативы промойте стероиды в PBS и закрепите в 4% параформальдегиде. Затем образцы встраивают в среду ОКТ и замораживают для срезов криостата и иммунофлуоресцентного окрашивания для анализа методом проточной цитометрии. Промойте стероиды в PBS и диссоциируйте с помощью трипсина или аккутана при 37 градусах Цельсия.

Полная диссоциация стероидов в одноклеточную суспензию может быть достигнута путем пипетирования раствора вверх и вниз с помощью наконечника для пипетки объемом в один миллилитр. Следите за тем, чтобы не раздувать размеры клеток, нейтрализуйте реакцию равным объемом питательной среды и удаляйте клеточные комки, пропуская суспензию через клеточное сетчатое фильтр размером от 40 до 70 микрон. Затем гранулируйте клетки и промывайте PBS и пересчитайте желаемое количество клеток в буфере и окрашивании в соответствии с инструкциями производителя В нашей лаборатории мы частично трансформировали эпителиальные клетки яичников и совместно культивировали эти клетки с нормальными и стареющими фибробластами яичников, чтобы имитировать развитие рака яичников на ранней стадии.

Иммунофлуоресцентное окрашивание яичников в пременопаузе показало, что как первичные нормальные фибробласты яичников, так и иммортализированные нормальные фибробласты яичников экспрессируют специфический белок фибробластов, но они не экспрессируют цитокератин 7 и экспрессируют ментон. Нормальные клетки фибробластов яичников, культивируемые только в 3D-форме ПГЭ, демонстрируют веретенообразную морфологию и обильный внеклеточный матрикс. Здесь нормальные фибробласты яичников подвергались воздействию перекиси водорода, чтобы вызвать старение в течение семи дней, а затем культивировались с частично трансформированными эпителиальными клетками яичников в течение 14 дней.

Чтобы различать эти два типа клеток, полученные стероиды подвергали иммуноокрашиванию на mim one в качестве маркера пролиферации и панцитокератина в качестве эпителиального маркера. Количественная оценка данных позволяет предположить, что стареющее микроокружение способствует неопластическим особенностям частично трансформированных эпителиальных клеток, в то время как нормальное микроокружение препятствует неопластической прогрессии, гистологическим особенностям нормальных и злокачественных клеток, которые не обнаруживаются при культивировании клеток по мере восстановления монослоев. Например, когда клетки переходят в сфероидную культуру, гистологические особенности светлоклеточного рака яичников могут быть обнаружены в 3D-культурах клеточных линий светлоклеточного рака яичников, но не в монослойных культурах тех же клеток.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создавать трехмерные типические культуры, с помощью которых можно изучать взаимодействие между эпителиальными и стромальными клетками. Во время раннего опухолевого генеза. При настройке 3D-культуры важно настроить количество клеток в соответствии с последующим применением, что позволяет избежать некоторой потери материала во время обработки.

После освоения 3D-культуры можно настроить в течение одного часа после этой процедуры. Другие методы, такие как проточная цитометрия в сочетании с микропрофилированием экспрессии генов, могут быть выполнены для анализа глобальных изменений экспрессии генов, которые происходят в 3D-типичных культурах, но не обнаруживаются в условиях монослойной культуры. Это позволит препарировать двунаправленные сигнальные пути, которые происходят именно в 3D-культуре ядра. Микроокружения.